INTRODUZIONE: CBFA2T3-GLIS2 è un gene di fusione presente nel 15-25% delle AMKL. L’obiettivo di questo studio è stato quello di ingegnerizzare delle iPSC con CBFA2T3-GLIS2. METODI E RISULTATI: Per ingegnerizzare le iPSC da donatore abbiamo sfruttato il locus AAVS. Il locus AAV, usato generalmente per l’integrazione dall’adenovirus codifica per il gene PPP1R12C e la sua distruzione non associa con alcuna patologia conosciuta.Il gene di fusione è stato clonato nel vettore AAVS1 SA-2A-puro-pA donor. Per riprodurre un modello altamente fedele siamo andati a verificare l’espressione di CBFA2T3 nelle iPSC. I risultati hanno dimostrato che il gene non era espresso nelle iPSC (Figura 1A), quindi abbiamo inserito il gene di fusione marcato con GFP sotto il controllo di un promotore ematopoietico, il CD43. Le iPSC sono state quindi ingegnerizzate con questo vettore attraverso ricombinazione omologa “ZingFinger” mediata (Figura 1B). Dopo elettroporazione le iPSC sono state selezionate con Puromicina. Su 24 colonie resistenti all’antibiotico, 23 avevano integrato CBFA2T3-GLIS2 in omozigosi e 1 in eterozigosi. 3 di queste colonie sono state amplificate e validate per le caratteristiche di pluripotenza e per l’espressione di CBFA2T3-GLIS2 nelle cellule ematopoietiche differenziate. I risultati hanno dimostrato che le iPSC ingegnerizzate avevano mantenuto le caratteristiche di pluripotenza (Figura 1C) e il gene di fusione insieme a altri geni direttamente regolati da CBFA2T3-GLIS2 come ERG erano correttamente espressi nelle cellule ematopoietiche derivate dalla differenzazione delle iPSC (Figura 1C). CONCLUSIONI: Le iPSC ingegnerizzate nel locus AAVS1 sono un modello altamente fedele e efficiente per studiare l’effetto di fusioni di interessa onco-ematologico.
MODELLO DI “INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS” (IPSC) DERIVATE DA DONATORE SANO CON IL GENE DI FUSIONE CBFA2T3-GLIS2
A. Astolfi;
2018
Abstract
INTRODUZIONE: CBFA2T3-GLIS2 è un gene di fusione presente nel 15-25% delle AMKL. L’obiettivo di questo studio è stato quello di ingegnerizzare delle iPSC con CBFA2T3-GLIS2. METODI E RISULTATI: Per ingegnerizzare le iPSC da donatore abbiamo sfruttato il locus AAVS. Il locus AAV, usato generalmente per l’integrazione dall’adenovirus codifica per il gene PPP1R12C e la sua distruzione non associa con alcuna patologia conosciuta.Il gene di fusione è stato clonato nel vettore AAVS1 SA-2A-puro-pA donor. Per riprodurre un modello altamente fedele siamo andati a verificare l’espressione di CBFA2T3 nelle iPSC. I risultati hanno dimostrato che il gene non era espresso nelle iPSC (Figura 1A), quindi abbiamo inserito il gene di fusione marcato con GFP sotto il controllo di un promotore ematopoietico, il CD43. Le iPSC sono state quindi ingegnerizzate con questo vettore attraverso ricombinazione omologa “ZingFinger” mediata (Figura 1B). Dopo elettroporazione le iPSC sono state selezionate con Puromicina. Su 24 colonie resistenti all’antibiotico, 23 avevano integrato CBFA2T3-GLIS2 in omozigosi e 1 in eterozigosi. 3 di queste colonie sono state amplificate e validate per le caratteristiche di pluripotenza e per l’espressione di CBFA2T3-GLIS2 nelle cellule ematopoietiche differenziate. I risultati hanno dimostrato che le iPSC ingegnerizzate avevano mantenuto le caratteristiche di pluripotenza (Figura 1C) e il gene di fusione insieme a altri geni direttamente regolati da CBFA2T3-GLIS2 come ERG erano correttamente espressi nelle cellule ematopoietiche derivate dalla differenzazione delle iPSC (Figura 1C). CONCLUSIONI: Le iPSC ingegnerizzate nel locus AAVS1 sono un modello altamente fedele e efficiente per studiare l’effetto di fusioni di interessa onco-ematologico.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
