Lo splicing aberrante del pre-RNA indotto da mutazioni è causa frequente (>20%) di deficienze gravi di fattore VII (FVII) e IX (FIX, emofilia B) della coagulazione. Esse possono causare gravi emorragie, talora fatali, ed il loro trattamento è associato a gravi compliTProgetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile PINOTTI MIRKO Telethon grant N. GGP09183 Totale € 345.300 Num Centri: 2 Durata (anni): 3 Anno d’inizio: 2009 canze. Dato che anche livelli ridotti di fattore FVII/FIX (>3%) possono ripristinare l’emostasi, queste patologie rappresentano modelli ideali per valutare approcci terapeutici innovativi. RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII/FIX MEDIANTE U1snRNA MODIFICATE IN MODELLI CELLULARI L’espressione di minigeni specifici per F7/F9 ha portato a definire il meccanismo causativo di 25 mutazioni differenti nel sito donatore di splicing (5’ss), caratterizzato da “exon skipping” e/o attivazione di siti criptici. Abbiamo dimostrato come la componente chiave dello spliceosoma U1snRNA, modificata per legarsi mediante complementarietà al 5’ss mutato, sia capace di correggere efficacemente numerose mutazioni nel 5’ss. Inoltre, queste U1snRNA sono risultate capaci di correggere alcune mutazioni nel sito accettore di splicing (3’ss). Mediante costrutti di cDNA competenti per lo splicing, si è dimostrato come la correzione dello splicing produca livelli significativi di FVII/FIX secreto e con attività coagulante (da non rilevabile a >10% per il FVII, fino 100% per il FIX). Per aumentare la specificità di sequenza bersaglio, abbiamo disegnato U1snRNA complementari a sequenze introniche non conservate a valle del 5’ss (U1snRNA Esone Specifiche, EXSpeU1), e dimostrato un gradiente di efficacia che decresce all’aumentare della distanza. La ExSpeU1 migliore (ExSpeU1-FIX+9) ha ripristinato la secrezione e la funzione (~90%) del FIX in presenza di diverse mutazioni sia al 5’ss che al 3’ss. RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII IN MODELLI ANIMALI In modelli cellulari, l’U1snRNA+5a (U1+5a) ripristina parzialmente (~10%) l’espressione del FVII umano (hFVII) compromessa dalla mutazione c.840+5G>A nel 5’ss dell’IVS7. Nei topi, abbiamo studiato il ripristino mediato da U1+5a, sia transiente (attraverso vettori non virali) che prolungato (vettori virali adenoassociati [AAV]), mediante co-espressione del minigene del FVII mutato (FVII+5A) e di U1+5a. In entrambi i sistemi sperimentali, trascritti normali di FVII erano apprezzabili negli epatociti. La co-espressione transiente della U1+5a ha prodotto la comparsa di hFVII negli epatociti e livelli di proteina circolante fino a 367ng/ml (~17% of wt-hFVII). L’espressione prolungata di hFVII circolante, e dose-dipendente (da non rilevabile a 30ng/ml), è stata dimostrata con vettori virali. CONCLUSIONI Per la prima volta si è i) dimostrata la correzione di varie mutazioni di splicing mediante un’unica ExSpeU1, e i livelli di FVII/FIX raggiunti, se ottenuti nei pazienti, risulterebbero terapeutici e ii) fornita la “proof-of-principle- in vivo del potenziale terapeutico della correzione mediata da U1snRNA per mutazioni di splicing, una causa frequente di patologie genetiche umane.
RNA-based therapeutic approaches for blood coagulation factor deficiencies caused by a splicing mutations
Balestra Dario;Cavallari Nicola;Barbon Elena;Ferraresi Paolo;Branchini Alessio;Campioni Matteo;Baroni Marcello;Pagani Franco;Pinotti Mirko
2013
Abstract
Lo splicing aberrante del pre-RNA indotto da mutazioni è causa frequente (>20%) di deficienze gravi di fattore VII (FVII) e IX (FIX, emofilia B) della coagulazione. Esse possono causare gravi emorragie, talora fatali, ed il loro trattamento è associato a gravi compliTProgetti di Ricerca Telethon - Altre Malattie Genetiche Responsabile PINOTTI MIRKO Telethon grant N. GGP09183 Totale € 345.300 Num Centri: 2 Durata (anni): 3 Anno d’inizio: 2009 canze. Dato che anche livelli ridotti di fattore FVII/FIX (>3%) possono ripristinare l’emostasi, queste patologie rappresentano modelli ideali per valutare approcci terapeutici innovativi. RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII/FIX MEDIANTE U1snRNA MODIFICATE IN MODELLI CELLULARI L’espressione di minigeni specifici per F7/F9 ha portato a definire il meccanismo causativo di 25 mutazioni differenti nel sito donatore di splicing (5’ss), caratterizzato da “exon skipping” e/o attivazione di siti criptici. Abbiamo dimostrato come la componente chiave dello spliceosoma U1snRNA, modificata per legarsi mediante complementarietà al 5’ss mutato, sia capace di correggere efficacemente numerose mutazioni nel 5’ss. Inoltre, queste U1snRNA sono risultate capaci di correggere alcune mutazioni nel sito accettore di splicing (3’ss). Mediante costrutti di cDNA competenti per lo splicing, si è dimostrato come la correzione dello splicing produca livelli significativi di FVII/FIX secreto e con attività coagulante (da non rilevabile a >10% per il FVII, fino 100% per il FIX). Per aumentare la specificità di sequenza bersaglio, abbiamo disegnato U1snRNA complementari a sequenze introniche non conservate a valle del 5’ss (U1snRNA Esone Specifiche, EXSpeU1), e dimostrato un gradiente di efficacia che decresce all’aumentare della distanza. La ExSpeU1 migliore (ExSpeU1-FIX+9) ha ripristinato la secrezione e la funzione (~90%) del FIX in presenza di diverse mutazioni sia al 5’ss che al 3’ss. RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII IN MODELLI ANIMALI In modelli cellulari, l’U1snRNA+5a (U1+5a) ripristina parzialmente (~10%) l’espressione del FVII umano (hFVII) compromessa dalla mutazione c.840+5G>A nel 5’ss dell’IVS7. Nei topi, abbiamo studiato il ripristino mediato da U1+5a, sia transiente (attraverso vettori non virali) che prolungato (vettori virali adenoassociati [AAV]), mediante co-espressione del minigene del FVII mutato (FVII+5A) e di U1+5a. In entrambi i sistemi sperimentali, trascritti normali di FVII erano apprezzabili negli epatociti. La co-espressione transiente della U1+5a ha prodotto la comparsa di hFVII negli epatociti e livelli di proteina circolante fino a 367ng/ml (~17% of wt-hFVII). L’espressione prolungata di hFVII circolante, e dose-dipendente (da non rilevabile a 30ng/ml), è stata dimostrata con vettori virali. CONCLUSIONI Per la prima volta si è i) dimostrata la correzione di varie mutazioni di splicing mediante un’unica ExSpeU1, e i livelli di FVII/FIX raggiunti, se ottenuti nei pazienti, risulterebbero terapeutici e ii) fornita la “proof-of-principle- in vivo del potenziale terapeutico della correzione mediata da U1snRNA per mutazioni di splicing, una causa frequente di patologie genetiche umane.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
