L’Unità Ferrara 1 si propone di caratterizzare dal punto di vista farmacologico e biochimico ligandi di nuova sintesi per i recettori di membrana attraverso i seguenti aspetti sperimentali: a) La prima parte del progetto sarà finalizzata, mediante saggi di “binding”, utilizzando radioligandi altamente selettivi, a condurre un’analisi sistematica dei recettori espressi su tessuti nativi di animali da esperimento e in cellule trasfettate con recettori umani. Gli esperimenti di saturazione saranno condotti utilizzando 8-10 concentrazioni crescenti di radioligandi altamente affini e selettivi per il recettore in esame. Gli esperimenti di inibizione saranno effettuati utilizzando 6-8 concentrazioni di ciascuno dei nuovi ligandi sintetizzati dalle Unità che compartecipano a questo progetto di ricerca. In particolare saranno condotti esperimenti di inibizione del “binding” a diverse temperature nell’intervallo 0-37°C allo scopo di verificare come varia l’affinità dei nuovi composti in funzione della temperatura (Varani et al., 2000). Il tempo di incubazione sarà opportunamente stabilito ad ogni temperatura grazie a specifici esperimenti di cinetica del binding recettoriale. Il radioligando libero sarà separato da quello legato mediante una filtrazione rapida sottovuoto attraverso filtri a fibra di vetro con un apparato di filtrazione Brandel. La radioattività trattenuta dai filtri sarà determinata mediante uno scintillatore Beckman Tri Carb 2500 (efficienza del 57%). I risultati sperimentali ottenuti saranno utilizzati per valutare i parametri termodinamici quali energia libera, entropia ed entalpia (Borea et al., 2000). b) La seconda fase sarà dedicata a correlare i dati di “binding” con alcuni eventi post-recettoriali. A questo proposito sarà determinata la funzionalità delle proteine G accoppiate con i recettori in esame misurando la capacità di stimolare il legame di [35S]-GTPgammaS (Gessi et al., 1999). c) Per quanto riguarda il sistema effettore saranno misurati i livelli di cAMP stimolati da forskolin valutando l’effetto di nuovi composti sulla produzione di cAMP. Le cellule in esame saranno risospese in un opportuno tampone e preincubate per 10 minuti in un bagno termostatato a 37°C. Saranno testati i nuovi ligandi sintetizzati a concentrazioni crescenti e tenuti in incubazione per 10 minuti. La reazione terminerà aggiungendo una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 6%. La soluzione finale ottenuta dopo centrifugazione sarà testata per determinare i livelli di cAMP seguendo il metodo descritto da Varani et al. 2003. d) Inoltre, dal momento che le concentrazioni di calcio sono critiche nel mantenere i livelli di attività di molti processi intracellulari, saranno condotti esperimenti per misurare i cambiamenti di questo importante secondo messaggero tramite un indicatore fluorescente FURA 2/AM. In particolare sarà studiato l’effetto di particolari mutazioni nel dominio extracellulare o nella regione intracitoplasmatica del recettore P2X7 sui meccanismi di trasduzione del segnale e sulla produzione dei secondi messaggeri (Ferrari et al., 2000). e) Infine gli effetti del segnale mediato dal calcio intracellulare sarà studiato usando approcci tipicamente molecolari. A questo scopo si utilizzeranno l’impiego del clonaggio in vettori di espressione e per siRNA specifici, trasfezione e trasduzione di linee cellulari tessuto specifiche, RT-PCR Real Time, espressione genica, tecniche di immunocitochimica, misurazioni del calcio subcellulare e saggi di legame al DNA da parte di fattori trascrizionali attivati dal calcio (Aguiari et al., 2003). Aguiari G et al, Biochem Biophys Res Commun, 301, 657-664, 2003. Ferrari D et al, FASEB J, 14, 2466-2476, 2000. Borea PA et al, Biochem Pharmacol, 11, 1549-1556, 2000. Gessi S et al, Life Sci, 64, 1403-1413, 1999. Varani K et al, Mol Pharmacol, 57, 968-975, 2000. Varani K et al, FASEB J, 17, 2148-2150, 2003.
Progetto: FIRB2003 Unità di Ferrara. Sviluppo ed applicazione di tecnologie altamente innovative ed efficienti per la sintesi di nuove molecole con dimostrazione della loro attività biologica su proteine di membrana implicate nel danno cerebrale
BOREA, Pier Andrea
2005
Abstract
L’Unità Ferrara 1 si propone di caratterizzare dal punto di vista farmacologico e biochimico ligandi di nuova sintesi per i recettori di membrana attraverso i seguenti aspetti sperimentali: a) La prima parte del progetto sarà finalizzata, mediante saggi di “binding”, utilizzando radioligandi altamente selettivi, a condurre un’analisi sistematica dei recettori espressi su tessuti nativi di animali da esperimento e in cellule trasfettate con recettori umani. Gli esperimenti di saturazione saranno condotti utilizzando 8-10 concentrazioni crescenti di radioligandi altamente affini e selettivi per il recettore in esame. Gli esperimenti di inibizione saranno effettuati utilizzando 6-8 concentrazioni di ciascuno dei nuovi ligandi sintetizzati dalle Unità che compartecipano a questo progetto di ricerca. In particolare saranno condotti esperimenti di inibizione del “binding” a diverse temperature nell’intervallo 0-37°C allo scopo di verificare come varia l’affinità dei nuovi composti in funzione della temperatura (Varani et al., 2000). Il tempo di incubazione sarà opportunamente stabilito ad ogni temperatura grazie a specifici esperimenti di cinetica del binding recettoriale. Il radioligando libero sarà separato da quello legato mediante una filtrazione rapida sottovuoto attraverso filtri a fibra di vetro con un apparato di filtrazione Brandel. La radioattività trattenuta dai filtri sarà determinata mediante uno scintillatore Beckman Tri Carb 2500 (efficienza del 57%). I risultati sperimentali ottenuti saranno utilizzati per valutare i parametri termodinamici quali energia libera, entropia ed entalpia (Borea et al., 2000). b) La seconda fase sarà dedicata a correlare i dati di “binding” con alcuni eventi post-recettoriali. A questo proposito sarà determinata la funzionalità delle proteine G accoppiate con i recettori in esame misurando la capacità di stimolare il legame di [35S]-GTPgammaS (Gessi et al., 1999). c) Per quanto riguarda il sistema effettore saranno misurati i livelli di cAMP stimolati da forskolin valutando l’effetto di nuovi composti sulla produzione di cAMP. Le cellule in esame saranno risospese in un opportuno tampone e preincubate per 10 minuti in un bagno termostatato a 37°C. Saranno testati i nuovi ligandi sintetizzati a concentrazioni crescenti e tenuti in incubazione per 10 minuti. La reazione terminerà aggiungendo una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 6%. La soluzione finale ottenuta dopo centrifugazione sarà testata per determinare i livelli di cAMP seguendo il metodo descritto da Varani et al. 2003. d) Inoltre, dal momento che le concentrazioni di calcio sono critiche nel mantenere i livelli di attività di molti processi intracellulari, saranno condotti esperimenti per misurare i cambiamenti di questo importante secondo messaggero tramite un indicatore fluorescente FURA 2/AM. In particolare sarà studiato l’effetto di particolari mutazioni nel dominio extracellulare o nella regione intracitoplasmatica del recettore P2X7 sui meccanismi di trasduzione del segnale e sulla produzione dei secondi messaggeri (Ferrari et al., 2000). e) Infine gli effetti del segnale mediato dal calcio intracellulare sarà studiato usando approcci tipicamente molecolari. A questo scopo si utilizzeranno l’impiego del clonaggio in vettori di espressione e per siRNA specifici, trasfezione e trasduzione di linee cellulari tessuto specifiche, RT-PCR Real Time, espressione genica, tecniche di immunocitochimica, misurazioni del calcio subcellulare e saggi di legame al DNA da parte di fattori trascrizionali attivati dal calcio (Aguiari et al., 2003). Aguiari G et al, Biochem Biophys Res Commun, 301, 657-664, 2003. Ferrari D et al, FASEB J, 14, 2466-2476, 2000. Borea PA et al, Biochem Pharmacol, 11, 1549-1556, 2000. Gessi S et al, Life Sci, 64, 1403-1413, 1999. Varani K et al, Mol Pharmacol, 57, 968-975, 2000. Varani K et al, FASEB J, 17, 2148-2150, 2003.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
