Progetto Giovani Ricercatori Universita' di Ferrara dal titolo: Caratterizzazione dell'espressione e funzionalità di recettori P2 in cellule staminali mesenchimali umane.

I recettori P2 per l’adenosina trifosfato (ATP) sono espressi da virtualmente tutte le cellule nelle quali svolgono svariate funzioni come la trasmissione del segnale nervoso, la formazione del trombo piastrinico, la produzione di citochine, la proliferazione e la morte cellulare. Possono essere suddivisi per struttura molecolare e tipo di vie di segnale attivate in due famiglie: i recettori metabotropici P2Y, che sono recettori formati da sette domini trasmembrana accoppiati a proteine G, ed i recettori ionotropici P2X che sono canali di membrana attivati dall’ATP. Alcuni studi recenti hanno dimostrato come L’ATP e l’UTP, due agonisti fisiologici dei recettori P2, siano in grado di determinare un aumento della proliferazione sia in cellule staminali embrionali murine (Heo and Han 2006) che in cellule staminali emopoietiche umane CD34+ (Lemoli et al. 2004, Wang et al. 2004) fungendo da potenti fattori di crescita in combinazione con appropriati cocktail citochinici. Inoltre, nelle cellule staminali emopoietiche (CD34+) l’UTP è anche in grado di stimolare la migrazione chemiotattica inibendo la degradazione del recettore CXCR4 (Rossi et al. 2006). La scoperta di nuove sostanze che, come i nucleotidi, siano in grado di promuovere la proliferazione, il movimento e quindi l’homing, o il differenziamento verso una specifica linea cellulare delle cellule staminali è di particolare interesse considerate le possibili applicazioni di queste cellule per la riparazione dei tessuti ed i trapianti. Tra i recettori purinergici dei buoni candidati a svolgere queste funzioni sono i recettori P2Y2 e P2Y4 che legano l’UTP e sono coinvolti nella proliferazione degli oligodendrociti ed astrociti ma anche di cellule tumorali (Burnstock 2006) ed il recettore P2X7; quest’ultimo lega l’ATP ed è noto per la sua duplice funzione di promotore dell’apoptosi o della sopravvivenza cellulare a seconda del tipo di cellula coinvolta e della concentrazione di agonista applicata (Adinolfi et al. 2005a e b). Il recettore P2X7 media inoltre il rilascio di una serie di citochine tra le quali le interleuchine 1, 6 e 18 (Ferrari et al. 2006). Per questo progetto ci proponiamo di analizzare l’espressione e di caratterizzare la funzione dei vari sottotipi P2 in un diverso tipo di cellula staminale la cui caratterizzazione funzionale è in uno stadio iniziale: le cellule stromali mesenchimali (MSC) di origine midollare. Le MSC sono cellule multipotenti che se opportunamente coltivate e stimolate sono in grado di differenziarsi in molti tipi cellulari diversi da quello di origine quali osteoblasti, condrociti, miociti, adipociti ma anche cellule endoteliali e neuronali. Le MSC sono in genere isolate dal midollo osseo ma rappresentano una popolazione molto esigua della popolazione midollare totale (0,001-0,01%). Quindi l’eventuale ruolo pro-proliferativo di ATP ed UTP potrebbe risultare particolarmente utile per la loro espansione in vitro. Studi recenti (Campioni et al., 2006 autore coinvolto in questo progetto), hanno inoltre dimostrato come il trattamento con cocktail citochinici possa modulare l’espressione di alcuni recettori citoplasmatici e di membrana favorendo il differenziamento delle MSC verso un lineage piuttosto che un altro. Noi ci proponiamo di verificare se questo sia il caso anche di alcuni recettori purinergici. Infatti ,così come è accaduto per le cellule emopoietiche o staminali, lo studio dei recettori P2 potrebbe fornire nuove informazioni sulle vie di segnale coinvolte nella crescita e nel differenziamento anche delle MSC . Il nostro intento sperimentale è dunque quello di verificare le capacità proliferative e le caratteristiche immunofenotipiche di cellule MSC coltivate in diverse condizioni sperimentali come il trattamento con e senza citochine, in presenza di ATP, UTP ed eventualmente altri agonisti P2. Ci proponiamo inoltre di caratterizzare l’espressione di recettori P2, utilizzando metodiche di RT-PCR, Western blotting, citometria a flusso e tramite la misura delle risposte calcio all’applicazione di specifici agonisti ed antagonisti P2. I primer, gli anticorpi e gli agonisti ed antagonisti P2 sono disponibili nel nostro laboratorio e sono stati già utilizzati per la caratterizzazione dell’espressione P2 in svariati tipi cellulari. Sono inoltre attualmente in via di sviluppo siRNA per poter silenziare i vari recettori con la metodica di RNA interference. Le cellule MSC estratte e purificate da midollo osseo come descritto in precedenza (Campioni et al. 2003) verranno fornite dalla dottoressa Diana Campioni della sezione di Ematologia e il loro profilo di espressione immunofenotipica verrà analizzato prima e dopo il trattamento con i nucleotidi mediante citometria a 4 colori. Le MSC verranno anche isolate da soggetti affetti da patologie ematologiche quali ad esempio il mieloma multiplo e le sindromi mielodisplastiche nella cui eziopatogenesi è fortemente coinvolta la componente stromale mesenchimale e dove è stata dimostrata un’intensa attività angiogenica in corso di patologia (Campioni et al. 2004, Lanza et al. 2003). Ci proponiamo infatti di analizzare anche un eventuale coinvolgimento dei recettori purinergici nella modificazione del microabiente citochinico che potrebbe indurre le MSC ad influenzare la trasformazione dei blasti patologici o comportare la trasformazione neoplastica delle stesse MSC. In conclusione i risultati di questo progetto potrebbero risultare particolarmente utili per la messa a punto di nuovi protocolli sperimentali utili a garantire la proliferazione o il differenziamento in vitro di cellule stromali mesenchimali da utilizzare eventualmente nella riparazione tissutale o per i trapianti. I recettori P2 potrebbero risultare dei buoni marcatori immunofenotipici per determinate sottoclassi MSC e permetterne anche la caratterizzazione funzionale. Questo studio potrebbe, quindi, costituire un buon modello in vitro per studiare la genesi di sottopopolazioni fenotipiche di MSC con diverse capacità funzionali in grado di alterare l’omeostasi tessutale in vivo anche in corso di patologie ematologiche.