Vav1 sustains the PDX1/miR-375/insulin axis during differentiation of hiPSCs to β cells: a potential target to improve the in vitro generation of insulin-producing cells

Introduzione. Il diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia autoimmune cronica caratterizzata dalla distruzione selettiva delle cellule β pancreatiche e da una carenza di insulina che rende necessaria la somministrazione permanente dell’ormone. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) rappresentano una fonte preziosa per la generazione di cellule produttrici di insulina (IPCs), costituendo un potenziale approccio per le terapie sostitutive delle cellule β. Tuttavia, nonostante i progressi nei protocolli di differenziamento, ottenere cellule β pienamente funzionali rimane una importante sfida, rendendo essenziale comprendere i meccanismi molecolari che guidano la loro specifica maturazione. Scopo. Studi precedenti hanno evidenziato che la proteina multidominio Vav1, nota per regolare la trascrizione genica e l’espressione di microRNA, è cruciale sia per la maturazione delle cellule staminali dell’albero biliare umano (hBTSC) in cellule β-simili, sia per la trans-differenziamento delle cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) in IPC. Alla luce di queste evidenze, questo progetto ha esplorato il coinvolgimento di Vav1 nella generazione di IPCs a partire da hiPSCs. Materiali e Metodi. Le hiPSC, riprogrammate a partire da cellule CD34+, sono state differenziate in cellule β mediante un protocollo di differenziamento sequenziale consolidato. L’espressione dei marcatori di ciascuna fase (OCT4, CXCR4, NKX6.1, PDX1, INS, GCG) è stata analizzata tramite citofluorimetria. Dopo aver confrontato diverse miscele liposomiche (siPORT™ NeoFX™, Lipofectamine™ RNAiMAX, Lipofectamine™ 2000), la Lipofectamine™ 2000 è risultata la più efficiente per la modulazione di Vav1 (≈35% di efficienza). Vav1 è stato down-modulato trasfettando le cellule allo stadio di progenitore endocrino (EP) con 150 pMol di siRNA specifici per Vav1, mentre la sua overespressione è stata ottenuta mediante trasfezione transiente con 2 μg di plasmide pEF-Vav1-myc. L’espressione di Vav1, insulina, PDX1, miR-375 e di Akt, è stata valutata mediante analisi immunochimiche, immunocitochimiche e/o RT-qPCR. Risultati. Durante il differenziamento, Vav1 ha mostrato un pattern dinamico e stadio-dipendente. I suoi livelli risultavano elevati nelle fasi iniziali del differenziamento, diminuivano nelle fasi intermedie e aumentavano nuovamente quando le cellule si impegnavano nella linea endocrina, raggiungendo un picco allo stadio di EP, seguito da una diminuzione nella fase terminale di maturazione, suggerendo un coinvolgimento di Vav1 nelle fasi tardive della maturazione. Gli studi funzionali hanno confermato tale ipotesi, in quanto la modulazione di Vav1 nelle cellule EP influenzava l’espressione dell’insulina e dei principali regolatori della maturazione e della funzione delle cellule β. Livelli adeguati di Vav1 sostenevano l’espressione di PDX1, fattore chiave per la sintesi di insulina e l’identità β-cellulare, nonché del suo target miR-375, fondamentale per il mantenimento della massa β. Inoltre, variazioni fisiologiche o indotte dei livelli di Vav1 erano correlate a modificazioni significative nell’attivazione di Akt, cruciale per la sopravvivenza e la secrezione insulinica delle cellule β e regolata da miR-375. Discussione. Complessivamente, i risultati hanno evidenziato il ruolo cruciale di Vav1 nella generazione di IPCs da hiPSC, delineando per la prima volta un asse regolatorio Vav1/PDX1/miR-375/Akt. Questo circuito emerge come un nodo centrale nella regolazione della maturazione β-cellulare. Sebbene siano necessari ulteriori approfondimenti, la modulazione mirata di Vav1 potrebbe rappresentare una strategia promettente per ottimizzare il differenziamento delle cellule β, ridurre la presenza di cellule immature o non funzionali e migliorare la sicurezza, allo scopo di ottimizzare le prospettive terapeutiche per il trattamento del T1D.

Background. Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disorder in which the selective destruction of pancreatic β cells leads to insufficient insulin secretion and lifelong dependence on external insulin administration. Human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have become a valuable and renewable source for generating insulin producing cells (IPCs), offering a potential avenue for β cell replacement therapies. Nevertheless, despite notable advances in differentiation methodologies, the efficient production of fully functional β cells remain a major challenge, emphasizing the importance of clarifying the molecular mechanisms that guide β cell specification and maturation. Aim. Based on previous evidence indicating that the multidomain protein Vav1, known to regulate both gene transcription and microRNA expression in various cell models, is essential for both the maturation of human biliary tree stem cells (hBTSCs) into β-like cells and the trans-differentiation of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells into IPCs, this project explored the involvement of Vav1 in the generation of insulin producing cells from iPSC. Material and method. HiPSCs reprogrammed from CD34-enriched blood cells from healthy subjects using the Sendai virus technology, were differentiated to β cells by a well-established stepwise protocol and markers specific to each maturation stage, including OCT4, CXCR4, NKX6.1, PDX1, INS and GCG, were evaluated by flow cytometry. After testing different liposome mixtures (siPORT™ NeoFX™, Lipofectamine™ RNAiMAX, and Lipofectamine™ 2000), the optimization of Vav1 modulation in differentiating hiPSCs identified Lipofectamine™ 2000 (1 mg/ml, 48 h) as the most efficient transfection agent (≈35%). Vav1 modulation was performed in hiPSCs at the endocrine progenitor (EP) stage transfecting cells with 150 pMol of siRNAs specific for Vav1, while its overexpression was induced with 2 μg of pEF-Vav1-myc plasmid. The expression of Vav1, insulin, PDX1, miR-375 and Akt were evaluated by immunochemical, immunocytochemical, and/or RT-qPCR analyses. Result. During the stepwise differentiation of hiPSCs into IPCs, Vav1 expression showed a dynamic, stage-dependent pattern. Its level was high at the early stages of differentiation, decreased during the intermediate phases, and increase as cells committed to the endocrine lineage, reaching a distinct peak at the EP stage before a final decrease at the end of the maturation process. This trend suggested a role of Vav1 in the late phases of pancreatic lineage commitment. Functional studies confirmed this hypothesis, as Vav1 modulation in EP cells directly influenced insulin expression and key regulators of β cell maturation and function. Specifically, adequate Vav1 levels sustained the expression of PDX1, the master transcription factor driving insulin expression and β cell identity, as well as its target miR-375, which is essential for maintaining β cell mass. Furthermore, modifications of Vav1 expression, whether physiological or experimentally induced, were associated with significant changes in Akt activation, crucial for β cell survival and insulin secretion, and negatively regulated by miR-375. Discussion. Altogether, these findings established the crucial role of Vav1 in the generation of insulin producing cells and revealed a previously unrecognized Vav1/PDX1/miR-375/Akt axis that plays a pivotal role in coordinating the molecular events underlying β cell development from hiPSCs. Even though other investigations are required, our data suggest that the targeted modulation of Vav1 may represent a promising strategy to optimize β cell differentiation, reduce the presence of immature or non-functional cells, and enhance the overall safety and efficacy of stem cell based therapeutic approaches for T1D.