Preclinical evaluation of Hedgehog and PI3K/Akt/mTOR pathways inhibition: analysis of molecular mechanisms involved in T- and preB- Acute Lymphoblastic Leukemia cell models

Le leucemie linfoblastiche acute (ALL) di tipo T (T-ALL) e preB (preB-ALL) possono dipendere da un’attivazione aberrante delle vie PI3K/Akt/mTOR e Hedgehog (Hh), che sono vie di segnalazione intracellulari chiave con ruoli critici nella promozione della crescita, sopravvivenza e resistenza ai trattamenti delle cellule leucemiche. Sebbene il pathway PI3K/Akt/mTOR sia stato ampiamente studiato, il contributo di Gli1, un importante effettore trascrizionale a valle della via Hh, rimane in larga parte inesplorato nelle neoplasie ematologiche. Pertanto, il primo obiettivo di questo studio è stato identificare specifici inibitori della via Hh/Gli1 e analizzarli in combinazione con inibitori della via PI3K/Akt/mTOR, valutandone la citotossicità in modelli T-ALL e preB-ALL. Inoltre, abbiamo investigato diversi processi cellulari e modificazioni morfologiche coinvolte nella risposta cellulare all’inibizione delle due vie analizzate. A tal fine, linee cellulari di T-ALL (Jurkat, Molt-4, DND-41, ALL-SIL, CCRF-CEM) e preB-ALL (NALM-6, KOPN8 e SEM) sono state trattate con gli inibitori Hh GDC-0049 e Glasdegib (inibitori di Smo) e Gant-61 (inibitore di GLI1) per 48 e 72 ore, e con gli inibitori PI3K/Akt/mTOR MK-2206 (inibitore di AKT) e RAD-001 (inibitore di mTOR) per 24 e 48 ore, sia singolarmente sia in combinazione. La vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio CCK-8, mentre apoptosi, distribuzione del ciclo cellulare e autofagia sono state analizzate tramite citofluorimetria. L’espressione delle proteine totali e fosforilate a valle delle due vie (come Akt, mTOR, GSK3αβ, p70S6K e Gli1) è stata analizzata tramite Western Blotting e la localizzazione di Akt, mTOR e Gli1 fosforilati è stata osservata mediante immunofluorescenza. L’analisi ultrastrutturale è stata eseguita mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I modelli cellulari T-ALL e preB-ALL si sono dimostrati sensibili al trattamento con Gant-61, mostrando una citotossicità significativa, ulteriormente incrementata in combinazione con MK-2206 o RAD-001, evidenziando una rilevante sinergia. In entrambe le linee cellulari T- e preB-ALL, l’espressione della proteina Gli1 e la fosforilazione di Akt e dei suoi target a valle risultavano ridotte in seguito a trattamento con Gant-61, MK-2206 o RAD-001 somministrati singolarmente. La combinazione dei farmaci ha accentuato ulteriormente la riduzione dell’espressione o fosforilazione delle proteine analizzate. Le immagini ottenute tramite microscopia a fluorescenza hanno confermato che la fosforilazione di Akt (in Jurkat, Molt-4, SEM e NALM-6) o mTOR (in KOPN8) è diminuita in seguito a trattamento con MK-2206, RAD-001 o GANT-61 singoli e si è ridotta ulteriormente dopo il trattamento combinato. Nelle linee cellulari T-ALL, la somministrazione combinata ha svolto un ruolo significativo nell’indurre arresto del ciclo cellulare in fase G0/G1 e nell’aumentare l’apoptosi, mentre nelle linee preB-ALL l’effetto sinergico del trattamento combinato sembra aver indotto l’attivazione del processo autofagico, come confermato anche dall’analisi TEM. L’analisi ultrastrutturale ha evidenziato la presenza di vacuoli autofagici e modificazioni mitocondriali. In conclusione, i risultati ottenuti suggeriscono che la somministrazione combinata di farmaci diretti ai principali componenti delle vie Hh e PI3K/Akt/mTOR è in grado di bloccare la proliferazione cellulare esercitando un effetto sinergico, inducendo processi di morte cellulare accompagnati da significativi cambiamenti morfologici. Tale approccio rappresenta quindi una potenziale strategia per il trattamento della T-ALL e della preB-ALL, sostenendo una promettente opzione terapeutica per superare la resistenza ai trattamenti nella leucemia.

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) T- (T-ALL) and preB- (preB-ALL) subtypes have been described to depend on aberrant activation of PI3K/AKT/mTOR and Hedgehog (Hh), that are key intracellular signaling pathways with critical roles in promoting leukemic cell growth, survival, and resistance to therapy. While the PI3K/AKT/mTOR axis has been extensively studied, the contribution of Gli1, a key downstream transcriptional effector of the Hh pathway, remains largely unexplored in hematologic malignancies. Therefore, the first aim of the research was to identify specific inhibitors of Hh/Gli1 pathway and analyze them in combination with PI3K/AKT/mTOR inhibitors and to evaluate their cytotoxicity in T-ALL and preB-ALL models. Finally, we investigated several cellular processes and morphological modifications involved in the cellular response to the inhibition of the two pathways analyzed. For this purpose, T-ALL (Jurkat, Molt-4, DND-41, ALL-SIL, CCRF-CEM) and preB-ALL (NALM-6, KOPN8 and SEM) cell lines were treated with Hh inhibitors GDC-0049 and Glasdegib (Smo inhibitors) and GANT-61 (GLI1 inhibitor) for 48 and 72 hours and with PI3K/Akt/mTOR inhibitors MK-2206 (AKT inhibitor) and RAD-001 (mTOR inhibitor) for 24 and 48 hours alone and in combination. Cell viability was assessed by the CCK-8 assay, whereas apoptosis, cell cycle distribution and autophagy were analyzed by flow cytometry. The expression of total and phosphorylated downstream proteins of the two pathways (such as Akt, mTOR, GSK3αβ, p70S6K and Gli1) was analyzed by Western Blotting and the localization of phosphorylated Akt, mTOR and Gli1 was observed by Immunofluorescence. Ultrastructural analysis has been achieved by Transmission Electron Microscopy (TEM). T-ALL and preB-ALL cell models were sensitive to treatment with Gant-61, exhibiting significant cytotoxicity, which increased in combination with MK-2206 or RAD-001, highlighting a relevant synergy. In both T- and preB-ALL cell lines, Gli1 protein expression and the phosphorylation of Akt and of its downstream targets were reduced by Gant-61 or by MK-2206 or RAD-001 when administered alone. Drug combination further increased the reduction of protein expression or phosphorylation of the targets analyzed. Images obtained by fluorescence microscope confirmed that the phosphorylation of Akt (in Jurkat, Molt-4, SEM and NALM-6) or mTOR (in KOPN8) was decreased by MK-2206 or RAD-001 or Gant-61 alone and further decreased after the combined treatment. In T-ALL cell lines, dual administration played a significant role in inducing cell cycle arrest in the G0/G1 phase, increasing apoptosis, while in preB-ALL cell lines, the synergistic effect of the combined treatment appears to induce the activation of the autophagic process, as also confirmed by TEM analysis. Ultrastructural analysis showed the presence of autophagic vacuoles and mitochondrial modifications. In conclusion, the results obtained suggest that the combined administration of drugs targeting the main components of the Hh and PI3K/Akt/mTOR pathways appears to block cell proliferation by exerting a synergistic effect, inducing cell death processes accompanied by significant morphological changes, thus representing a potential strategy for the treatment of T-ALL and preB-ALL, supporting a promising therapeutic strategy to overcome treatment resistance in leukemia.