La citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) e la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP) rappresentano meccanismi immunitari essenziali nel controllo dell’infezione da HIV-1, integrando l’attività neutralizzante degli anticorpi. I vaccini tradizionali diretti contro la proteina Env, altamente variabile, hanno ottenuto successi limitati, aprendo la strada a antigeni alternativi come Tat, fondamentale per la replicazione virale e la regolazione immunitaria. Negli individui infetti, gli anticorpi anti-Tat si associano a progressione malattia più lenta, migliore controllo della viremia residua e recupero efficace dei CD4+, stimolando lo sviluppo di vaccini capaci di elicitare risposte immunitarie robuste e multifunzionali per potenziare gli approcci convenzionali. Per analizzare le funzioni effettrici anticorpali, abbiamo adattato un saggio RFADCC (Rapid Fluorometric ADCC) utilizzando sieri da persone senza HIV (PLWoH) e con HIV (PLWH). Le PBMC effettrici hanno mediato ADCC contro cellule bersaglio CEM.NKr CCR5+ pulsate con antigeni HIV (Tat/Env), doppiamente marcate e opsonizzate con anticorpi monoclonali, policlonali o sieri delle coorti. La citometria a flusso ha quantificato la citotossicità e le interazioni effettore-bersaglio, mentre microscopia a fluorescenza, confocale e time-lapse ha rivelato dinamiche cellulari e sottogruppi effettrici coinvolti. Il saggio RFADCC si è rivelato affidabile, rapido, quantitativo, sensibile, economico, riproducibile e ottimale per screening sierologico ad alto rendimento. Anticorpi monoclonali e policlonali, insieme ai sieri, inducono ADCC contro Tat/Env, con efficacia guidata dalla specificità anticorpale: i monoclonali privilegiano forme Env specifiche, mentre i policlonali generano risposte ampie e cross-clade contro conformazioni monomeriche e trimeriche, indipendentemente da clade o livello. I sieri PLWH mostrano citotossicità trasversale verso varianti Env, e un siero iperimmune anti-Tat da coniglio ha evidenziato elevata uccisione cellulare, confermando Tat come target vaccinale promettente. In particolare, i monociti CD14+ emergono come protagonisti nell’ADCC anti-Tat: formano coniugati stabili con i bersagli e sinergizzano con altre cellule immunitarie per amplificare la citotossicità, evidenziando meccanismi monocito-guidati e reti cooperative cruciali nell’immunità anticorpo-mediata contro HIV. Questo studio convalida il RFADCC come strumento versatile per la ricerca vaccinale anti-HIV, dimostrando che specificità anti-Env/Tat elicitano citotossicità Fc-mediata e supportando l’inclusione di Tat per espandere l’immunità antivirale. Il potenziamento di attività fagocitiche e citotossiche si profila come strategia innovativa per vaccini mirati a deplezione dei serbatoi virali e contenimento della progressione malattia, valorizzando la cooperazione multi-cellulare in approcci terapeutici e preventivi.
Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) are crucial immune mechanisms that contribute to the control of HIV-1 infection beyond the neutralization activity of antibodies. Traditional vaccine efforts aimed at inducing neutralizing antibodies against the highly variable Env protein have shown limited success, prompting the exploration of alternative antigens as well as the combination of different protective immune mechanisms. In this context, Tat plays a pivotal role in viral replication and immune regulation. Moreover, while naturally occurring anti-Tat antibodies are rare in infected individuals, their presence has been correlated with slower disease progression. These observations have led to the development of vaccination strategies targeting Tat, designed to induce robust and multifunctional immune responses that may complement or enhance the efficacy of traditional approaches. To accurately evaluate these antibody effector functions, a Rapid Fluorometric ADCC (RFADCC) assay was adapted and employed. The assay utilized two cohorts of sera from two cohorts: people living without HIV (PLWoH) and people living with HIV (PLWH). PBMCs were tested for their ability to mediate ADCC against CEM NKr CCR5+ target cells pulsed with HIV antigens, which were dual-labeled and opsonized with specific antibodies and serum from both cohorts. Flow cytometry enabled quantification of cytotoxicity and assessment of effector–target interactions. Complementary imaging approaches including fluorescence, confocal, and live-cell time-lapse microscopy were applied to track the cellular dynamics and identify the effector subsets involved in the ADCC responses. The RFADCC assay is reliable, fast, quantitative, sensitive, cost-effective, reproducible, and easy to implement for high-throughput serum screening. Both monoclonal and polyclonal antibodies, as well as sera, mediate ADCC responses against Tat- or Env-pulsed target cells, with the antibody specificity determining the response. In particular, the results show that monoclonal antibodies mediate cytotoxic activity preferentially towards specific forms of the Env antigen, while polyclonal antibodies induce broader and cross-sectional ADCC responses against different conformations (monomeric and trimeric forms) of the protein, regardless of clade or tier. Similarly, human sera from PLWH possess cross-clade cytotoxic capacity against Env variants with different levels of sensitivity. We observed ADCC in target cells pulsed with the Tat protein and incubated with a hyperimmune serum from a rabbit immunized with Tat, detecting high killing activity. These findings suggest that Tat could represent a novel and promising antigenic target for ADCC-based vaccine strategies. The combined analysis showed that CD14+ monocytes play a key role in Tat-specific ADCC by forming stable conjugates with target cells and working synergistically with other immune cells to enhance cytotoxicity, emphasizing the importance of monocyte-driven mechanisms and cooperative effector networks in antibody-mediated HIV immunity. The study confirms the RFADCC assay as a reliable, versatile tool for evaluating ADCC responses in HIV vaccine research. It demonstrates that different antibody specificities can induce cytotoxicity against both Env- and Tat-pulsed targets, supporting the potential inclusion of Tat in vaccines to enhance Fc-mediated antiviral immunity. The enhancement of phagocytic and cytotoxic activities thus emerges as a promising approach for future vaccine design aimed at reducing viral reservoirs and slowing disease progression. Moreover, the observed cooperation among effector cell subsets underscores the complexity of antibody-dependent antiviral mechanisms and the need to consider multiple cellular components when developing therapeutic and preventive strategies against HIV.
Comprehensive characterization of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) against the HIV-1 Tat and Env antigens
MARTINO, MARA
2026
Abstract
La citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) e la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP) rappresentano meccanismi immunitari essenziali nel controllo dell’infezione da HIV-1, integrando l’attività neutralizzante degli anticorpi. I vaccini tradizionali diretti contro la proteina Env, altamente variabile, hanno ottenuto successi limitati, aprendo la strada a antigeni alternativi come Tat, fondamentale per la replicazione virale e la regolazione immunitaria. Negli individui infetti, gli anticorpi anti-Tat si associano a progressione malattia più lenta, migliore controllo della viremia residua e recupero efficace dei CD4+, stimolando lo sviluppo di vaccini capaci di elicitare risposte immunitarie robuste e multifunzionali per potenziare gli approcci convenzionali. Per analizzare le funzioni effettrici anticorpali, abbiamo adattato un saggio RFADCC (Rapid Fluorometric ADCC) utilizzando sieri da persone senza HIV (PLWoH) e con HIV (PLWH). Le PBMC effettrici hanno mediato ADCC contro cellule bersaglio CEM.NKr CCR5+ pulsate con antigeni HIV (Tat/Env), doppiamente marcate e opsonizzate con anticorpi monoclonali, policlonali o sieri delle coorti. La citometria a flusso ha quantificato la citotossicità e le interazioni effettore-bersaglio, mentre microscopia a fluorescenza, confocale e time-lapse ha rivelato dinamiche cellulari e sottogruppi effettrici coinvolti. Il saggio RFADCC si è rivelato affidabile, rapido, quantitativo, sensibile, economico, riproducibile e ottimale per screening sierologico ad alto rendimento. Anticorpi monoclonali e policlonali, insieme ai sieri, inducono ADCC contro Tat/Env, con efficacia guidata dalla specificità anticorpale: i monoclonali privilegiano forme Env specifiche, mentre i policlonali generano risposte ampie e cross-clade contro conformazioni monomeriche e trimeriche, indipendentemente da clade o livello. I sieri PLWH mostrano citotossicità trasversale verso varianti Env, e un siero iperimmune anti-Tat da coniglio ha evidenziato elevata uccisione cellulare, confermando Tat come target vaccinale promettente. In particolare, i monociti CD14+ emergono come protagonisti nell’ADCC anti-Tat: formano coniugati stabili con i bersagli e sinergizzano con altre cellule immunitarie per amplificare la citotossicità, evidenziando meccanismi monocito-guidati e reti cooperative cruciali nell’immunità anticorpo-mediata contro HIV. Questo studio convalida il RFADCC come strumento versatile per la ricerca vaccinale anti-HIV, dimostrando che specificità anti-Env/Tat elicitano citotossicità Fc-mediata e supportando l’inclusione di Tat per espandere l’immunità antivirale. Il potenziamento di attività fagocitiche e citotossiche si profila come strategia innovativa per vaccini mirati a deplezione dei serbatoi virali e contenimento della progressione malattia, valorizzando la cooperazione multi-cellulare in approcci terapeutici e preventivi.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
