Questa ricerca di dottorato esplora come sostenibilità e innovazione tecnologica possano unirsi nello sviluppo di strategie analitiche avanzate per la purificazione e la caratterizzazione di composti bioattivi in matrici complesse. La chimica analitica moderna deve evolversi integrando strumenti avanzati, pratiche sostenibili e una solida conoscenza dei meccanismi di separazione, per affrontare sfide che spaziano dalla purificazione di farmaci agli studi metabolomici. Il lavoro si articola in due linee principali. La prima riguarda l’uso di approcci cromatografici più sostenibili, attraverso l’impiego di alternative più green rispetto all’acetonitrile (ACN) nella cromatografia liquida a fase inversa (RPLC). Il dimetil carbonato (DMC) è stato valutato come solvente green analizzandone le proprietà fisico-chimiche e la forza eluente, e successivamente testato su scala analitica e preparativa. Le metriche ambientali hanno mostrato prestazioni equivalenti o migliori rispetto all’ACN, con un impatto ambientale minore. L’uso combinato di DMC e isopropanolo (IPA) ha ridotto l’E-factor fino al 43% e il procedure hazard value (PHV) fino all’80% nella purificazione di peptidi terapeutici (semaglutide, degarelix e salmon calcitonin), mantenendo inalterate purezza e resa. Questi risultati confermano la validità del DMC per processi di purificazione più sostenibili. La seconda linea di ricerca ha sviluppato workflow avanzati di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC–MS) per lo studio di matrici biologiche e vegetali complesse. Questi metodi combinano cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) e RPLC con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS), in modalità targeted e untargeted. Le applicazioni includono studi di permeabilità intestinale e la caratterizzazione metabolomica di estratti di Hypericum perforatum (Erba di San Giovanni). Nel campo biomedico, il workflow HILIC–RP ha permesso la separazione e la quantificazione accurata di lattulosio e mannitolo, fondamentali nei test di permeabilità intestinale. L’integrazione di analisi targeted e untargeted ha anche consentito il monitoraggio dei farmaci nei campioni clinici, migliorando l’interpretazione dei dati e la verifica dell’aderenza terapeutica. Negli studi fitochimici, la combinazione di colonne HILIC e RPLC ha mostrato la complementarità tra i due sistemi, permettendo l’identificazione di numerosi metaboliti bioattivi, soprattutto polifenoli con proprietà antiossidanti. L’approccio ortogonale ha ampliato la copertura metabolomica, con circa 50 composti identificati negli estratti idroalcolici. Il workflow può essere inoltre utilizzato per studiare come diverse tecniche di estrazione influenzino la composizione chimica degli estratti. Questa ricerca rappresenta anche un passo verso l’uso futuro della cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC) accoppiata a HRMS, che potrà aumentare ulteriormente la copertura metabolomica e la capacità di risolvere coppie critiche non separate in LC monodimensionale. Nonostante le attuali difficoltà legate alla complessità degli strumenti, alla gestione dei dati e all’impatto ambientale dei solventi, l’evoluzione della chimica analitica verso soluzioni più green e digitali costituirà la base per la prossima generazione di metodologie analitiche. Nel complesso, le due linee di ricerca convergono su un obiettivo comune: sviluppare approcci analitici flessibili, sostenibili e ad alte prestazioni per la caratterizzazione di campioni complessi. Attraverso innovazioni nei solventi e nelle strategie di separazione multidimensionale, questo lavoro contribuisce alla costruzione di una chimica analitica più efficiente, ecologica e orientata ad analisi high-throughput.
This Ph.D. research investigates how sustainability and technological innovation can converge to advance analytical strategies for purifying and characterizing bioactive compounds in complex matrices. Modern analytical chemistry must evolve through cutting-edge instrumentation, environmentally responsible practices, and a deep understanding of separation mechanisms. This enables innovative analytical solutions for challenges ranging from pharmaceutical purification to metabolomic studies. The work was structured in two complementary phases. The first focused on implementing green chromatographic approaches by adopting sustainable alternatives to acetonitrile (ACN) in reversed-phase liquid chromatography (RPLC). Dimethyl carbonate (DMC) was explored as a green solvent. Its suitability was assessed through physico-chemical properties and elution strength, then tested on an analytical scale for small molecules and for preparative purification of model peptides. DMC proved a promising alternative, offering higher elution strength and comparable chromatographic performance. Also, green metrics were calculated to compare with ACN performance. Combining DMC with isopropanol (IPA) reduced the E-factor by 15%, 43%, and 11% in the purification of semaglutide, degarelix, and salmon calcitonin, respectively, while the procedure hazard value (PHV) decreased by about 70–80% in all cases. These improvements were achieved without compromising recovery or purity, confirming DMC-based protocols as viable and sustainable options for green preparative applications. The second phase developed advanced liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) workflows for characterizing complex biological, biomedical, and phytochemical matrices. These exploit the orthogonality of hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and RPLC, integrated with high-resolution mass spectrometry (HRMS) in targeted and untargeted modes. Applications include intestinal permeability studies, where a dual LC-MS setup alternates HILIC and RP data acquisition within a single sequence, and metabolomic profiling of Hypericum perforatum extracts, where parallel HILIC and RPLC runs provide complementary metabolite coverage. In biomedical applications, the dual HILIC-RP workflow achieved isomeric resolution for sugars relevant to intestinal permeability testing, enabling precise lactulose and mannitol quantification across five orders of magnitude. Incorporating targeted assays within untargeted metabolomics also enabled drug monitoring in clinical specimens, ensuring robust data interpretation for complex biological analyses. For phytochemical studies, the orthogonality between amide based HILIC and C18 RP columns allowed complementary identification of bioactive compounds in H. perforatum extracts, through an untargeted approach focused on polyphenols, compounds with significant antioxidant properties. The dual setup revealed distinct retention behaviors and efficiency of the columns tested, and expanded metabolite coverage. Analyses of hydroalcoholic extracts identified about 50 compounds, mainly antioxidant polyphenols. The workflow can be extended to explore compositional shifts under different extraction conditions. This research also represents a conceptual step toward implementing two-dimensional liquid chromatography (2D-LC). Coupled with HRMS, 2D-LC offers enhanced resolution and data richness, requiring advanced data processing, statistical, and chemometric tools to extract meaningful information. Overall, the two research streams converge on a common goal: designing flexible, high-performance analytical approaches for complex real-world samples. Whether through solvent innovation or multidimensional separations, this work emphasizes mechanistic understanding and strategic method development are pivotal to advance separation science and pave the way for future research integrating big data analysis and sustainable practices.
High throughput methods and novel approaches for the characterization and purification of bioactive compounds in different matrices
SPEDICATO, MATTEO
2026
Abstract
Questa ricerca di dottorato esplora come sostenibilità e innovazione tecnologica possano unirsi nello sviluppo di strategie analitiche avanzate per la purificazione e la caratterizzazione di composti bioattivi in matrici complesse. La chimica analitica moderna deve evolversi integrando strumenti avanzati, pratiche sostenibili e una solida conoscenza dei meccanismi di separazione, per affrontare sfide che spaziano dalla purificazione di farmaci agli studi metabolomici. Il lavoro si articola in due linee principali. La prima riguarda l’uso di approcci cromatografici più sostenibili, attraverso l’impiego di alternative più green rispetto all’acetonitrile (ACN) nella cromatografia liquida a fase inversa (RPLC). Il dimetil carbonato (DMC) è stato valutato come solvente green analizzandone le proprietà fisico-chimiche e la forza eluente, e successivamente testato su scala analitica e preparativa. Le metriche ambientali hanno mostrato prestazioni equivalenti o migliori rispetto all’ACN, con un impatto ambientale minore. L’uso combinato di DMC e isopropanolo (IPA) ha ridotto l’E-factor fino al 43% e il procedure hazard value (PHV) fino all’80% nella purificazione di peptidi terapeutici (semaglutide, degarelix e salmon calcitonin), mantenendo inalterate purezza e resa. Questi risultati confermano la validità del DMC per processi di purificazione più sostenibili. La seconda linea di ricerca ha sviluppato workflow avanzati di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC–MS) per lo studio di matrici biologiche e vegetali complesse. Questi metodi combinano cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) e RPLC con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS), in modalità targeted e untargeted. Le applicazioni includono studi di permeabilità intestinale e la caratterizzazione metabolomica di estratti di Hypericum perforatum (Erba di San Giovanni). Nel campo biomedico, il workflow HILIC–RP ha permesso la separazione e la quantificazione accurata di lattulosio e mannitolo, fondamentali nei test di permeabilità intestinale. L’integrazione di analisi targeted e untargeted ha anche consentito il monitoraggio dei farmaci nei campioni clinici, migliorando l’interpretazione dei dati e la verifica dell’aderenza terapeutica. Negli studi fitochimici, la combinazione di colonne HILIC e RPLC ha mostrato la complementarità tra i due sistemi, permettendo l’identificazione di numerosi metaboliti bioattivi, soprattutto polifenoli con proprietà antiossidanti. L’approccio ortogonale ha ampliato la copertura metabolomica, con circa 50 composti identificati negli estratti idroalcolici. Il workflow può essere inoltre utilizzato per studiare come diverse tecniche di estrazione influenzino la composizione chimica degli estratti. Questa ricerca rappresenta anche un passo verso l’uso futuro della cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC) accoppiata a HRMS, che potrà aumentare ulteriormente la copertura metabolomica e la capacità di risolvere coppie critiche non separate in LC monodimensionale. Nonostante le attuali difficoltà legate alla complessità degli strumenti, alla gestione dei dati e all’impatto ambientale dei solventi, l’evoluzione della chimica analitica verso soluzioni più green e digitali costituirà la base per la prossima generazione di metodologie analitiche. Nel complesso, le due linee di ricerca convergono su un obiettivo comune: sviluppare approcci analitici flessibili, sostenibili e ad alte prestazioni per la caratterizzazione di campioni complessi. Attraverso innovazioni nei solventi e nelle strategie di separazione multidimensionale, questo lavoro contribuisce alla costruzione di una chimica analitica più efficiente, ecologica e orientata ad analisi high-throughput.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
