La Targeted Radionuclide Therapy rappresenta un approccio innovativo e promettente in oncologia che consente il rilascio selettivo di radiazioni ionizzanti verso bersagli molecolari per finalità diagnostiche e terapeutiche. Tra i target di crescente rilevanza clinica e scientifica si annoverano la Fibroblast Activation Protein (FAP) e il Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA). FAP, una serino proteasi appartenente alla famiglia delle Prolyl Oligopeptidasi, risulta iperespressa in circa il 90% dei carcinomi dove contribuisce ai processi di rimodellamento della matrice extracellulare favorendo la crescita e l’invasività della massa tumorale. Il PSMA, invece, rappresenta un marcatore consolidato per il carcinoma prostatico, uno dei tumori maligni più diffusi nella popolazione maschile. Nonostante i notevoli progressi e il crescente numero di candidati clinici, la progettazione di inibitori altamente selettivi, dotati di elevata affinità per il bersaglio e prolungato tempo di residenza, rimane una sfida importante. La complessità dello sviluppo di inibitori selettivi della proteina FAP è ulteriormente amplificata dalla mancanza di una struttura cristallografica in complesso con un ligando rappresentativo e dalla sua elevata omologia strutturale con altre proteine della famiglia, quali la Dipeptidyl Peptidase IV (DPP-IV) e la Prolyl Endopeptidase (PREP). Per chiarirne il meccanismo d’azione e le modalità di interazione con inibitori noti, sono state applicate tecniche computazionali di docking e dinamica molecolare. Le analisi strutturali hanno evidenziato la presenza di un sito attivo flessibile e idrofobico, identificando i residui amminoacidici coinvolti nella stabilizzazione del ligando. I modelli generati hanno contribuito a spiegare l’elevata affinità degli inibitori pseudo-peptidici, razionalizzando i dati di relazione struttura-attività noti. L’impiego di protocolli di dinamica covalente e calcoli di energia libera ha permesso di valutare l’effetto dell’introduzione di diversi sostituenti sullo scaffold peptidico volte a migliorare affinità, selettività e tempo di residenza. Parallelamente, gli studi dedicati al PSMA si sono concentrati sull’analisi dell’interazione del 18F-JK-PSMA-7, un radiotracciante selettivo di ultima generazione. Tali attività hanno incluso lo sviluppo di protocolli di produzione e caratterizzazione in conformità alle GMP con particolare attenzione agli aspetti di assicurazione della qualità. Inoltre, l’impiego di un approccio structure-based supportato da tecniche di docking ha consentito la progettazione di nuovi candidati con potenziale attività teranostica. La presente tesi ricostruisce il ciclo di vita di un radiofarmaco, dalla fase di progettazione alla produzione su larga scala, illustrandone sfide, risultati e limiti ed evidenziando come la modellistica molecolare in associazione ad un approccio multidisciplinare, possa contribuire in modo determinante allo sviluppo di molecole sicure, selettive ed efficaci.
Targeted Radionuclide Therapy is a promising approach in oncology which enables the selective delivery of radionuclides to molecular targets, combining tumour imaging with therapeutic efficacy1. Within this context, Fibroblast Activation Protein (FAP) and Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA) have gained increasing clinical and scientific relevance. FAP, a serine protease of the Prolyl Oligopeptidase family, is overexpressed in cancer associated fibroblasts where it promotes tumour growth and progression2, while PSMA, is a validated marker for prostate cancer, one of the most common malignancies in men3. Despite numerous advances and dozens of clinical candidates, designing selective inhibitors with high target affinity and prolonged residence time, remains a major challenge. Further complicating FAP targeting is the lack of a three-dimensional structure in complex with a representative compound and its high structural similarity to other family members, including Dipeptidyl Peptidase IV (DPP-IV) and Prolyl Endopeptidase (PREP). To elucidate its biological behaviour, advanced computational methods were employed, combining molecular docking and dynamics to characterise thermodynamic and kinetic profiles of inhibitors at FAP and structurally related proteins. Structural analysis revealed a flexible, hydrophobic active site and highlighted residues critical for ligand stabilization, contributing to the affinity of pseudo-peptide inhibitors4. Customised protocols for covalent dynamics and free energy calculations further clarified binding energetics, testing scaffold substitutions aimed at improving affinity, selectivity, and residence time. PSMA-focused studies investigated the interaction mode of 18F-JK-PSMA-75, a latest-generation selective radiotracer. Efforts included the development of GMP production protocols with a focus on quality assurance, laying the foundation for large-scale diagnostic application. Furthermore, a structure-based approach supported by template-based docking techniques was implemented, enabling the design of new candidates with potential theranostic activity, aimed at overcoming the limitations associated with the renal and hepatic accumulation of known inhibitors. This thesis follows the life cycle of a radiopharmaceutical, from design to industrial-scale production, outlining challenges, achievements, and limitations, and highlighting the role of molecular modelling and multidisciplinary strategies in advancing safer and effective theranostic molecules. (1) Dash, A.; Knapp, F. F.; Pillai, M. Targeted Radionuclide Therapy - An Overview. Curr. Radiopharm. 2013, 6 (3), 152–180. https://doi.org/10.2174/18744710113066660023. (2) Glabman, R. A.; Choyke, P. L.; Sato, N. Cancer-Associated Fibroblasts: Tumorigenicity and Targeting for Cancer Therapy. Cancers 2022, 14 (16), 3906. https://doi.org/10.3390/cancers14163906. (3) Oldan, J. D.; Almaguel, F.; Voter, A. F.; Duran, A.; Gafita, A.; Pomper, M. G.; Hope, T. A.; Rowe, S. P. PSMA-Targeted Radiopharmaceuticals for Prostate Cancer Diagnosis and Therapy. Cancer J. 2024, 30 (3), 176–184. https://doi.org/10.1097/PPO.0000000000000718. (4) Jansen, K.; Heirbaut, L.; Verkerk, R.; Cheng, J. D.; Joossens, J.; Cos, P.; Maes, L.; Lambeir, A.-M.; De Meester, I.; Augustyns, K.; Van Der Veken, P. Extended Structure–Activity Relationship and Pharmacokinetic Investigation of (4-Quinolinoyl)Glycyl-2-Cyanopyrrolidine Inhibitors of Fibroblast Activation Protein (FAP). J. Med. Chem. 2014, 57 (7), 3053–3074. https://doi.org/10.1021/jm500031w. (5) Zlatopolskiy, B. D.; Endepols, H.; Krapf, P.; Guliyev, M.; Urusova, E. A.; Richarz, R.; Hohberg, M.; Dietlein, M.; Drzezga, A.; Neumaier, B. Discovery of18 F-JK-PSMA-7, a PET Probe for the Detection of Small PSMA-Positive Lesions. J. Nucl. Med. 2019, 60 817–823. https://doi.org/10.2967/jnumed.118.218495.
Computational approaches for the rational design of radio-labelled pseudo-peptide chelators for theranostic applications
AGOSTA, FEDERICA
2026
Abstract
La Targeted Radionuclide Therapy rappresenta un approccio innovativo e promettente in oncologia che consente il rilascio selettivo di radiazioni ionizzanti verso bersagli molecolari per finalità diagnostiche e terapeutiche. Tra i target di crescente rilevanza clinica e scientifica si annoverano la Fibroblast Activation Protein (FAP) e il Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA). FAP, una serino proteasi appartenente alla famiglia delle Prolyl Oligopeptidasi, risulta iperespressa in circa il 90% dei carcinomi dove contribuisce ai processi di rimodellamento della matrice extracellulare favorendo la crescita e l’invasività della massa tumorale. Il PSMA, invece, rappresenta un marcatore consolidato per il carcinoma prostatico, uno dei tumori maligni più diffusi nella popolazione maschile. Nonostante i notevoli progressi e il crescente numero di candidati clinici, la progettazione di inibitori altamente selettivi, dotati di elevata affinità per il bersaglio e prolungato tempo di residenza, rimane una sfida importante. La complessità dello sviluppo di inibitori selettivi della proteina FAP è ulteriormente amplificata dalla mancanza di una struttura cristallografica in complesso con un ligando rappresentativo e dalla sua elevata omologia strutturale con altre proteine della famiglia, quali la Dipeptidyl Peptidase IV (DPP-IV) e la Prolyl Endopeptidase (PREP). Per chiarirne il meccanismo d’azione e le modalità di interazione con inibitori noti, sono state applicate tecniche computazionali di docking e dinamica molecolare. Le analisi strutturali hanno evidenziato la presenza di un sito attivo flessibile e idrofobico, identificando i residui amminoacidici coinvolti nella stabilizzazione del ligando. I modelli generati hanno contribuito a spiegare l’elevata affinità degli inibitori pseudo-peptidici, razionalizzando i dati di relazione struttura-attività noti. L’impiego di protocolli di dinamica covalente e calcoli di energia libera ha permesso di valutare l’effetto dell’introduzione di diversi sostituenti sullo scaffold peptidico volte a migliorare affinità, selettività e tempo di residenza. Parallelamente, gli studi dedicati al PSMA si sono concentrati sull’analisi dell’interazione del 18F-JK-PSMA-7, un radiotracciante selettivo di ultima generazione. Tali attività hanno incluso lo sviluppo di protocolli di produzione e caratterizzazione in conformità alle GMP con particolare attenzione agli aspetti di assicurazione della qualità. Inoltre, l’impiego di un approccio structure-based supportato da tecniche di docking ha consentito la progettazione di nuovi candidati con potenziale attività teranostica. La presente tesi ricostruisce il ciclo di vita di un radiofarmaco, dalla fase di progettazione alla produzione su larga scala, illustrandone sfide, risultati e limiti ed evidenziando come la modellistica molecolare in associazione ad un approccio multidisciplinare, possa contribuire in modo determinante allo sviluppo di molecole sicure, selettive ed efficaci.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
