Counteracting intervertebral disc degeneration: a contribution from the development of Wharton's jelly-based scaffolds and the investigation of the purinergic P2X7 receptor

Il lavoro di questa tesi ha avuto come scopo quello di fornire nuovi elementi per ottimizzare approcci terapeutici per contrastare la degenerazione del disco intervertebrale (IVDD). L'IVD, una giunzione fibrocartilaginea che collega due vertebre adiacenti, può andare incontro a degenerazione per diversi motivi (invecchiamento, traumi o infezioni), perdendo la sua funzionalità e causando mal di schiena, una malattia comune ancora senza cura. Durante il mio dottorato ho affrontato l'argomento seguendo due approcci: a. uno puramente molecolare riguardante l'identificazione di nuove molecole con ruoli critici nell'omeostasi dell'IVD, per sviluppare strategie terapeutiche mirate; b. l'altro legato all’ingegneria tissutale, finalizzato a sviluppare nuovi scaffold impiantabili basati sulla matrice di gelatina di Wharton decellularizzata (DWJM). In entrambi i casi il modello sperimentale utilizzato è rappresentato dalla coltura primaria di cellule IVD isolate da biopsie di pazienti con diverso grado di IVDD sottoposti a discectomia. L’approccio molecolare ha avuto lo scopo di studiare il recettore purinergico P2X7 (un canale ionico ATP-dipendente), dimostrando per la prima volta la sua localizzazione nel nucleo di cellule IVD, condrociti e osteoblasti e non solo sulla membrana plasmatica. Da qui l'ipotesi che P2X7R insieme a molecole partner da identificare possa agire come un collegamento tra l'esterno e l'interno, supportando sia l’IVDD sia svolgendo un ruolo nella meccanotrasduzione legata all'ATP extracellulare. I risultati principali sono stati: -l'espressione di P2X7R aumenta durante l’IVDD; -P2X7R è associato alla segnalazione di Ca++ attraverso l’interazione con il fattore di trascrizione NFATc1 in uno specifico complesso proteico; -NFATc1 è reclutato sul promotore del gene di P2X7R e ne aumenta l'espressione; -quando il fenotipo delle cellule IVD viene ripristinato dall'ipossia, l'espressione di P2X7R è diminuita da HIF-1α che viene reclutato sul promotore di P2RX7 spostando NFATc1; -P2X7R è associato alla lamina A/C, un componente principale della lamina nucleare, e a emerina, SUN2 e HDAC, tutti coinvolti nella regolazione della cromatina. Queste evidenze dimostrano per la prima volta che P2X7R e NFATc1 sono marcatori dell’IVDD. Inoltre, aprono la strada allo studio di ruoli di P2X7R non ancora descritti, avendo identificato proteine associate all'involucro nucleare come partners di P2X7R. L’approccio di ingegneria tissutale ha avuto lo scopo di sviluppare un sistema in vitro simile al microambiente dell’IVD, fornendo sia una piattaforma adatta a monitorare il comportamento cellulare sia le condizioni per ottimizzare nuovi scaffold. Questo ha portato all'utilizzo della DWJM, i cui componenti biologici e strutturali sono molto simili alla matrice extracellulare dell’IVD. I risultati principali sono stati: -quando coltivate in combinazione con la DWJM, le cellule IVD degenerate recuperano il loro fenotipo simile ai condrociti, esprimendo marcatori persi durante l’IVDD (SOX9, TRPS1, FOXO3a). Questo effetto è potenziato dall’ipossia, con l’aumento di HIF-1α che viene reclutato sul promotore di SOX9 e FOXO3a, proteine cruciali per l'omeostasi e la riparazione dell’IVD; -quando opportunamente combinata con alginato e gelatina, la DWJM forma millicilindri compositi (WJMs) più gestibili e geometricamente controllabili; -i WJMs con la più alta percentuale di DWJM resistono alle forze meccaniche, supportano l'attività delle cellule progenitrici/notocordali residenti (aumento delle cellule CD24-positive) e influenzano positivamente la migrazione cellulare, la proliferazione e il ripristino del fenotipo IVD (aumento dell'espressione di collagene di tipo II, aggrecano, SOX9 e FOXO3a). In conclusione, questa tesi ha portato alla luce nuovi elementi (molecolari e biomaterialistici) per progettare in futuro nuove terapie mirate per l'IVDD.

The work of this thesis was aimed at providing new elements to optimize therapeutic approaches to counteract intervertebral disc (IVD) degeneration. The IVD, a fibrocartilaginous junction that connects two adjacent vertebrae allowing limited movement, can undergo degeneration for different reasons (aging, trauma or infection), lose its functionality and cause back pain, a common disease that is still without a cure. During my PhD I addressed the topic following two main approaches: a. a more purely molecular one concerning the identification of new molecules that may play critical roles in IVD homeostasis, aimed to develop targeted therapeutic strategies; b. the other addressed to a tissue engineering field, aimed at developing new implantable scaffolds based on decellularized Wharton's jelly matrix (DWJM). In both cases the experimental model used were primary culture of IVD cells isolated from biopsies of patients undergoing discectomy with different grade of degeneration. The molecular field was aimed at studying the purinergic P2X7 receptor (an ATP-gated plasma membrane ion channel), that for the first time, we documented to be localized in the nucleus of IVD cells, chondrocytes, and osteoblasts and not only in the plasma membrane. From here we pursued the hypothesis that P2X7R together with partner molecules to be identified could act as a link between the outside and the inside both supporting the degeneration of the IVD and playing a role in the mechanotransduction that relies on extracellular ATP. The main results were: -P2X7R expression increased during the IVD degeneration; -P2X7R is associated with Ca++ signaling through a direct binding to the Ca++-sensing transcription factor NFATc1 in a specific protein complex; -NFATc1 is recruited at the P2RX7 gene promoter and increased P2X7R expression; -when the degenerated phenotype of IVD cells was reversed by hypoxia, P2X7R expression decreased by HIF-1α which is recruited at the P2RX7 promoter displacing NFATc1; -P2X7R is closely associated with lamin A/C, a major component of the nuclear lamina, emerin, SUN2 and HDAC, all involved in a chromatin regulatory network. With this evidence we identified for the first time that P2X7R and NFATc1 are markers of IVD degeneration. Moreover, we have opened the way to reasoning about roles of P2X7R not yet described, such as scaffold protein or regulator of gene expression, having identified specific protein associated with the nuclear envelope as partners of P2X7R. The field of tissue engineering has been to develop an in vitro system that mimics the IVD microenvironment, providing both a suitable platform to monitor cellular behavior and conditions to optimize new scaffolds. This led to the use of DWJM, whose biological and structural components are very similar to the IVD extracellular matrix. The main results were: -when cultured in combination with DWJM, degenerated IVD cells responded positively by recovering their chondrocyte-like phenotype, expressing markers lost during degeneration (SOX9, TRPS1, FOXO3a). This effect was enhanced when, after exposure to hypoxia, HIF-1α increased in the expression level and was recruited to the promoter of SOX9 and FOXO3a, which are crucial proteins for IVD homeostasis and repair; -when appropriately combined with alginate and gelatin, DWJM gave rise to more manageable and geometrically controllable composite millicylinders (WJMs); -WJMs with the highest percentage of DWJM were prone to resist mechanical forces, supported the activity of resident progenitor/notochordal cells (as shown by an increase in CD24-positive cells), positively affected cell migration, proliferation, and restoration of the IVD phenotype (as shown by an increase of collagen type II, aggrecan, SOX9, and FOXO3a expression). We can conclude that this thesis has brought to light new elements (molecular and biomaterialistic) to design in the future new targeted therapies for the regeneration of the degenerated IVD.