OxInflammasome and Nrf2 pathway deregulation in Autism Spectrum Disorder

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) è un termine ombrello che comprende una serie di disturbi del neurosviluppo caratterizzati principalmente da difficoltà nella comunicazione sociale e dalla presenza di comportamenti ripetitivi e interessi ristretti. Sebbene le vie molecolari che contribuiscono allo sviluppo dell'ASD non siano ancora completamente comprese, si ritiene che una combinazione di mutazioni genetiche, irregolarità del sistema immunitario ed esposizioni ambientali possa svolgere un ruolo chiave. Nella nostra ricerca, ci siamo concentrati sull'analisi del ruolo dei mitocondri, dell'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e della loro interazione, nonché della via redox-sensibile Nrf2 nei fibroblasti primari derivati da pazienti ASD e controlli (CTR), sia in condizioni basali che stimolate. In particolare, abbiamo utilizzato LPS seguito da ATP per indurre l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e MCC950 come inibitore selettivo dell'inflammasoma. Per valutare la funzionalità mitocondriale, abbiamo impiegato FCCP per indurre stress, mentre MitoTEMPO è stato usato come scavenger delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) mitocondriali. Per studiare la via Nrf2, le cellule sono state trattate con sulforafano (SFN), un composto del gruppo degli isotiocianati noto in letteratura come attivatore di Nrf2. I nostri risultati hanno mostrato che le cellule ASD presentavano un'attività aumentata dell'inflammasoma NLRP3, come evidenziato dalla co-localizzazione di NLRP3 e ASC, da livelli aumentati di oligomeri di ASC e da un incremento dei livelli di caspasi-1 attiva e IL-1β. Parallelamente, i mitocondri nelle cellule ASD mostravano livelli elevati di ROS, una morfologia alterata e una funzionalità ridotta. Importante, l’uso di MCC950 e MitoTEMPO ha fornito prove di un'interazione reciproca tra disfunzione mitocondriale e attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nel contesto dell'ASD. Infatti, l'impiego di MitoTEMPO è stato in grado di ridurre l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, mentre l'inibizione di quest'ultimo ha ripristinato la funzionalità mitocondriale nelle cellule ASD. I fibroblasti ASD hanno anche mostrato un'attivazione costitutiva di Nrf2, come evidenziato da un aumento della traslocazione nucleare rispetto ai CTR. Tuttavia, le cellule ASD non erano in grado di rispondere agli stimoli con SFN, mostrando, tra l'altro, una ridotta espressione genica e proteica di HO1. In questo contesto, abbiamo osservato un'espressione aumentata di KEAP1 e una maggiore presenza nucleare di BACH1 nelle cellule ASD. L'uso di emina, una molecola nota per indurre l'esportazione nucleare e la degradazione di BACH1, è stato in grado di ripristinare i livelli di trascrizione e sintesi proteica di HO1, dimostrando un ruolo negativo di BACH1 nella fisiopatologia dell'ASD. I nostri risultati suggeriscono nuovi potenziali target terapeutici e forniscono nuove informazioni sui meccanismi alla base del legame tra stress ossidativo e infiammazione nell'ASD, evidenziando in particolare il dialogo bidirezionale tra disfunzione mitocondriale e attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e descrivendo la deregolazione dell'asse KEAP1-Nrf2-BACH1.

Autism Spectrum Disorder (ASD) is an umbrella term for a range of neurodevelopmental disorders characterized primarily by challenges in social communication and the presence of repetitive behaviors and restricted interests. While the molecular pathways that contribute to the development of ASD are incompletely understood, it is thought that a combination of genetic mutations, immune system irregularities, and environmental exposures may play a role. In our research, we focused on investigating the role of mitochondria, the NLRP3 inflammasome activation, along with their interaction, and the Nrf2 redox-sensitive pathway in primary fibroblasts derived from ASD patients and controls (CTR) under both basal and stimulated conditions. Specifically, we used LPS followed by ATP to induce NLRP3 inflammasome activation and MCC950 as a selective inhibitor of the inflammasome. To assess mitochondrial function, FCCP was used to induce stress, while MitoTEMPO served as a scavenger of mitochondrial reactive oxygen species (ROS). Instead, to investigate the Nrf2 pathway, the cells were treated with sulforaphane (SFN), a compound from the isothiocyanate group known in the literature to be an activator of Nrf2. Our results showed that ASD cells exhibited increased NLRP3 inflammasome activity as evidenced by co-localization of NLRP3 and ASC, increased levels of ASC oligomers, and increased levels of active caspase-1 and IL-1β. In parallel, ASD mitochondria exhibited elevated ROS levels, altered morphology and reduced functionality. Importantly, the use of MCC950 and MitoTEMPO provided evidence for a reciprocal interaction between mitochondrial dysfunction and NLRP3 inflammasome activation in the context of ASD. Indeed, the use of MitoTEMPO was able to reduce NLRP3 inflammasome activation while inhibition of the latter restored mitochondrial function in ASD cells. ASD fibroblasts also showed constitutive activation of Nrf2, as evidenced by increased nuclear translocation compared to CTRs. However, ASDs were unable to respond to SFN stimuli, showing, among others, reduced gene and protein expression of HO1. In this context, we described an increased expression of KEAP1 and an increased nuclear presence of BACH1 in ASD cells. The use of hemin, a molecule known to induce nuclear export and degradation of BACH1, was able to restore the levels of HO1 transcription and protein synthesis, demonstrating a negative role of BACH1 in ASD pathophysiology. Our findings suggest potential new targets and provide new insights into the mechanisms underlying the oxidative stress-inflammation link in ASD, specifically highlighting the bidirectional crosstalk between mitochondrial dysfunction and NLRP3 inflammasome activation and describing the deregulation of the KEAP1-Nrf2-BACH1 axis.