Age-dependent modulation of G2019S LRRK2 on α-synuclein pathology and β-Glucocerebrosidase activity

La Malattia di Parkinson (MP) è una patologia neurodegenerativa, progressiva, multifattoriale e multisistemica, classificata come sinucleinopatia. Le caratteristiche neuropatologiche della MP sono l’accumulo di α-sinucleina mal ripiegata e fosforilata (nella forma di pSer129 α-sin) in aggregati insolubili denominati Corpi di Lewy e la neurodegenerazione nella Sostanza Nera pars compacta. In questo studio abbiamo combinato un aspetto eziologico (α-sin) e uno genetico (G2019S LRRK2) con l’invecchiamento al fine di riprodurre nei topi la natura multifattoriale della MP e per studiarne i meccanismi patogenetici alla base. In particolare, abbiamo investigato se e con che impatto G2019S LRRK2 modula la sinucleinopatia in presenza dell’invecchiamento. A questo scopo, abbiamo utilizzato il modello di sinucleinopatia basato sulla iniezione esogena di fibrille pre-formate di α-sin (α-sin PFF) per mimare la lenta progressione della patologia osservata in clinico. Abbiamo utilizzato topi G2019S KI e WT di 3 e 18 mesi di età, iniettati unilateralmente in striato con α-sin PFF e sacrificati a 1, 3 o 6 mesi p.i. La efficienza delle α-sin PFF nel replicare le fasi di seeding (innesco) e spreading (propagazione) della sinucleinopatia è stata confermata, per tutte le coorti sperimentali, mediante la rilevazione di inclusioni pSer129 α-sin+ in striato, SN, amigdala e corteccia somatosensoriale. Inoltre, le strutture dopaminergiche sono apparse maggiormente coinvolte nell’accumulo di inclusioni pSer129 α-sin+. Nella coorte dei topi di 18 mesi di età, ma non nei topi giovani, il genotipo G2019S KI è apparso meno suscettibile nell’accumulare inclusioni pSer129 α-sin+, più incline ad avere elevati livelli di TH striatale e a manifestare un fenotipo ansioso rispetto ai topi WT. I diversi tempi p.i. non hanno evidenziato differenze di genotipo nella sinucleinopatia. Una lieve neurodegenerazione nigro-striatale nei topi WT iniettati con α-sin PFF è stata riscontrata solo a 3 mesi p.i., mentre i maggiori livelli striatali di DAT e Iba-1 riscontrati a 6 mesi p.i. nei topi iniettati con α-sin PFF hanno suggerito, rispettivamente, un meccanismo compensatorio in risposta alla perdita di terminali dopaminergici e una lieve microgliosi tempo-dipendente. Per identificare i target neuropatologici chiave nella MP abbiamo investigato se e in che modo la mutazione G2019S di LRRK2 può modulare l’attività della β-Glucocerebrosidasi (β-GC), una idrolasi lisosomiale la cui omeostasi influenza la funzione lisosomiale. L’attività della β-GC, dei topi G2019S KI ha manifestato una maggiore suscettibilità all’inibizione indotta dal CBE in striato e mesencefalo. L’attività della β-GC è stata soggetta a cambiamenti età-dipendenti: i topi G2019S KI, LRRK2 Kinase Dead (con attività chinasica silenziata) e LRRK2 Knock-Out (privi di LRRK2) hanno mostrato un aumento dell’attività enzimatica a 12 ma non a 3 mesi di età, suggerendo il coinvolgimento di LRRK2, così come la sua attività chinasica, nella regolazione della β-GC. Tuttavia, ad 1 mese p.i. di α-sin PFF, l’attività della β-GC nei topi G2019S KI e WT di 3 e 18 mesi di età non è stata influenzata dalla sinucleinopatia, probabilmente perché 1 mese è un intervallo di tempo troppo breve per poter osservare variazioni nell’attività della β-GC imputabili alla sinucleinopatia. Il presente studio ha confermato l’efficacia delle α-sin PFF nel riprodurre l’accumulo patologico di inclusioni pSer129 α-sin+ in vivo. Tuttavia, la patologia dell’α-sin sembra essere dissociata dalla neurodegenerazione oppure sono richiesti tempi di osservazione p.i. più lunghi per poter apprezzare la perdita neuronale in questo modello. In conclusione, questo studio ha evidenziato, come riportato in clinico, il lieve impatto della mutazione G2019S di LRRK2 nella sinucleinopatia e il ruolo chiave dell’invecchiamento nel far emergere le differenze legate al genotipo.

Parkinson’s Disease (PD) is one of the most common progressive, multifactorial, and multisystem neurodegenerative disorder, classified as a synucleinopathy. In this sense, the neuropathological hallmarks of PD are the accumulation of misfolded and phosphorylated α-synuclein (as pSer129 α-syn) in insoluble aggregates called Lewy Bodies and the neurodegeneration in Substantia Nigra pars compacta. In this study we combined aetiological (α-syn) and genetic (G2019S LRRK2) aspects with ageing to recapitulate the multifactorial nature of PD in mice and to study the underlying pathogenic mechanisms. In particular, we investigated whether and with what extend G2019S LRRK2 modulates the synucleinpathy in presence of ageing. To this aim, we adopted the progressive synucleinopathy model based on the exogenous injection of pre-formed fibrils of α-syn (α-syn PFFs) to mimic the slow progression of pathology seen in the clinic. We used 3-month-old and 18-month-old G2019S KI and WT mice unilaterally injected in striatum with α-syn PFFs and sacrificed at 1, 3 or 6 months p.i. The efficiency of α-syn PFFs to replicate the seeding and spreading phases of synucleinopathy was confirmed for all the experimental cohorts by the detection of pSer129 α-syn+ inclusions in striatum (site of injection) and SN, amygdala, somatosensory cortex. Furthermore, we settled the main involvement of dopaminergic structures in the accumulation of pSer129 α-syn+ inclusions. In the cohort of 18-month-old mice, but not in the young mice, the G2019S KI genotype appeared less susceptible to accumulate pSer129 α-syn+ inclusions, to have higher levels of striatal TH and more prone to manifest an anxious phenotype compared to WT mice. The different time post-injection did not reveal genotype difference in the synucleinopathy. A mild nigro-striatal neurodegeneration in WT mice injected with α-syn PFFs was found just at 3 months post-injection while at 6 months the higher levels of striatal DAT and Iba-1 in α-syn PFFs-injected mice suggested, respectively, a compensatory mechanism in response to dopaminergic terminal demise and a time-dependent slight microgliosis. To identify key neuropathological targets in PD we investigated if and how the G2019S mutation of LRRK2 can modulate the activity of GCase, a lysosomal hydrolase, whose homeostasis affects lysosomal function. The GCase activity of G2019S KI mice manifested a greater susceptibility to Conduritol β-Epoxide-induced inhibition in striatum and midbrain. The activity of GCase was subject to age-dependent changes: G2019S KI, LRRK2 Kinase Dead and LRRK2 Knock-Out mice showed higher increased enzymatic activity at 12 months of age and not at 3 months of age. These results suggested that LRRK2 is involved in the regulation of GCase, as well as its kinase activity. However, GCase activity in 3-month-old and 18-month-old G2019S KI and WT mice was not affected by synucleinopathy at 1-month after the injection of α-syn PFFs, probably because 1-month is too short a time frame too short to see synucleinopathy-related changes in GCase activity. The present study confirmed the efficiency of α-syn PFFs in reproducing the pathological accumulation of pSer129 α-syn+ inclusions in vivo. However, α-syn pathology seems to be dissociated to neurodegeneration or longer observation times after-injection is required to appreciate neuronal loss in this model. Globally, this study highlighted, as in clinical, the mild impact of G2019S LRRK2 in the synucleinopathy and the key role of ageing in bringing out genotype-related differences.