DEVELOPMENT OF THERAPEUTIC STRATEGIES FOR THE TREATMENT OF SPINOCEREBELLAR ATAXIAS TYPE 1 AND 2 (SCA1 AND SCA2)

La SCA1 e la SCA2 sono due malattie neurodegenerative a trasmissione autosomica dominante, legate all'espansione di una ripetizione CAG che codifica per la glutammina. La presenza di un tratto poliespanso di glutammina o polyQ conferisce tossicità alla proteina risultante, che porta alla degenerazione di specifiche sottopopolazioni neuronali. Ad oggi non sono disponibili terapie per il trattamento della SCA1 o della SCA2. Un approccio promettente e interessante, tuttavia, è quello di silenziare i geni portatori della mutazione. Il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento di modifica del genoma molto promettente, con un enorme potenziale per rivoluzionare il campo della medicina. Questa tecnologia consente l'introduzione di modifiche in posizioni specifiche di geni selezionati. Ciò può comportare la creazione di delezioni o inserzioni, che alla fine portano al silenziamento genico o ad altre alterazioni genetiche desiderate. Con questo lavoro sono stati sviluppati diversi approcci terapeutici per il trattamento dell’atassia spinocerebellare di tipo 1 e di tipo 2, basati sul sistema CRISPR/Cas9. Per quanto riguarda la SCA1, è stato testato un approccio non allele-selettivo su fibroblasti isolati da pazienti SCA1, dimostrando la sua capacità di ridurre l'espressione della proteina atassina-1, sia mutata che sana, con ottime percentuali di soppressione. Tuttavia, questa strategia, non potendo discriminare l’allele mutato da quello sano, provoca anche una riduzione della proteina fisiologica. Per questo motivo è stata sviluppata anche una strategia allele-specifica, che può invece essere definita “personalizzata” perché dipende dalle caratteristiche genetiche di ciascun paziente. Si basa infatti sull'identificazione di SNP in grado di generare nuove PAM sull'allele mutato o di distruggere PAM esistenti su quello sano. I risultati preliminari ottenuti in seguito al trattamento dei fibroblasti SCA1 isolati da 2 pazienti sono molto promettenti. Tuttavia, le cellule della pelle non costituiscono un modello preciso e predittivo della malattia. Per questo motivo era necessario ottenere un modello cellulare più adatto e l'avvento delle tecnologie basate sulle cellule staminali pluripotenti indotte ha, infatti, aperto nuove prospettive in questo ambito. Le cellule staminali pluripotenti indotte sono state generate riprogrammando fibroblasti isolati da pazienti SCA1N1 e SCA1N5, attraverso la trasduzione di tre vettori virali derivati da un virus non integrativo. Dopo un'esauriente caratterizzazione essi verranno differenziati in iNeuroni su cui testare gli approcci terapeutici precedentemente sviluppati. Per quanto riguarda le ricerche sull'atassia spinocerebellare di tipo 2, ad oggi il personale del reparto di Neurologia dell'Azienda Ospedaliera Universitaria di Ferrara ha prelevato frammenti bioptici cutanei dai 18 pazienti SCA2 sottoposti allo studio, dai quali sono stati isolati fibroblasti. Per la progettazione degli sgRNA specifici per il gene ATXN2 è stato preso in considerazione l'esone 1. Sono stati quindi progettati sei sgRNA per effettuare un taglio a monte dell'espansione della tripletta CAG e sei sgRNA per riconoscere e tagliare una sequenza a valle della stessa regione. Le sette coppie di sgRNA che si sono rivelate più efficienti nell'eseguire il doppio taglio, dopo uno screening in vitro, sono state poi testate nei fibroblasti wild-type. La coppia che si è rivelata avere la migliore efficienza è stata selezionata per essere trasfettata in futuro in fibroblasti isolati da pazienti SCA2, al fine di sviluppare una strategia terapeutica non allele-selettiva per questa patologia. Allo stesso tempo, per consentire la progettazione di sgRNA allele-selettivi paziente-specifici, il DNA dei pazienti SCA2 e dei loro parenti stretti è stato sottoposto ad analisi genotipica per verificare la presenza di SNP che alterano la PAM.

SCA1 and SCA2 are two autosomal dominantly inherited neurodegenerative diseases, linked to the expansion of a CAG repeat that encodes glutamine. The existence of an elongated polyglutamine or polyQ tract imparts pathogenic characteristics to the resultant protein, leading to the degeneration of specific neuronal subpopulations. To date, there are no disease-modifying therapies available for SCA1 or SCA2. Given that the polyQ proteins involved in these diseases exert their effects through a dominant gain-of-function mechanism leading to neurotoxicity, a promising and appealing approach is to silence the genes carrying the mutation. This strategy holds the potential to slow down or even halt the progression of the diseases. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 has rapidly emerged as the most promising genome editing tool, holding tremendous potential to revolutionize the field of medicine. This technology enables the introduction of modifications into specific locations of selected genes in a single step. This can involve the creation of deletions or insertions, ultimately leading to gene silencing or other desired genetic alterations. With this work, various therapeutic approaches have been developed for the treatment of spinocerebellar ataxia type 1 and type 2, based on the CRISPR/Cas9 system. Regarding SCA1, a non allele-selective approach was tested on fibroblasts isolated from SCA1 patients, demonstrating its ability to reduce the expression of the ataxin-1 protein, both mutated and healthy, with excellent suppression percentages. However, this strategy, not being able to discriminate the mutated allele from the healthy one, also causes a reduction in the physiological protein. For this reason, an allele-specific strategy was also developed, which can instead be defined as "personalized" because it depends on the genetic characteristics of each patient. It is in fact based on the identification of SNPs which are capable of generating new PAMs on the mutated allele or destroying existing PAMs on the healthy one. The preliminary results obtained following the treatment of SCA1 fibroblasts isolated from 2 patients are very promising. However, skin cells do not constitute a precise and predictive model of the disease. For this reason it was necessary to obtain a more suitable cellular model and the advent of technologies based on induced pluripotent stem cells has, in fact, opened up new perspectives in this area. Induced pluripotent stem cells were then generated by reprogramming fibroblasts isolated from SCA1N1 and SCA1N5 patients, through the transduction of three viral vectors derived from a non-integrative virus. After an exhaustive characterization they will be differentiated into iNeurons on which to test the previously developed therapeutic approaches. As regards research on spinocerebellar ataxia type 2, to date the staff of the Neurology department of the University Hospital of Ferrara has taken skin biopsy fragments from the 18 SCA2 patients who underwent the study, from which fibroblasts were isolated. For the design of sgRNAs specific for the ATXN2 gene, exon 1 was taken into consideration. Six sgRNAs were therefore designed to make a cut upstream of the CAG triplet expansion and six guide RNAs to recognize and cut a sequence downstream of the same region. The seven pairs of sgRNAs that were most efficient at performing double cleavage following an in vitro screening were then tested in wild-type fibroblasts. The pair that was found to have the best efficiency was selected to be transfected in the future into fibroblasts isolated from SCA2 patients, in order to develop a non allele-selettive therapeutic strategy for this pathology. At the same time, to allow the design of patient-specific allele-selective sgRNAs, the DNA of SCA2 patients and their close relatives was subjected to genotypic analysis to verify the presence of PAM-altering SNPs.