Age-Related Macular Degeneration: a new prospect in cell therapy

Tra le numerose patologie della degenerazione retinica, la degenerazione maculare senile (AMD) è la causa più comune di cecità nel mondo occidentale. Gli eventi che si verificano durante la progressione della malattia portano alla disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). La terapia cellulare delle cellule RPE può preservare la vista e ripristinare la funzione retinica nei pazienti affetti da AMD. Nuovi studi hanno permesso di differenziare le cellule RPE da cellule staminali pluripotenti, garantendo così una fonte illimitata di cellule RPE. Per veicolare queste cellule nella parte posteriore dell'occhio, i metodi basati su scaffold sono in fase di sperimentazione clinica. A questo proposito, i tessuti da donatore possono essere utilizzati come matrici cellulari. In primo luogo ci siamo concentrati sulla membrana amniotica umana (hAM). Un'alternativa alla hAM si trova tra le strutture dell'occhio: la membrana di Descemet (DM). Questo studio si proponeva inizialmente di analizzare la sopravvivenza delle cellule RPE derivate da cellule embrionali umane (hESC-RPE) su hAM de-epitelizzata e DM decellularizzata. Abbiamo anche cercato di valutare l'integrazione in vivo di questa membrana utilizzando come modello animale il ratto. Infine, è stato condotto uno studio comparativo tra colture di cellule RPE su diversi scaffold selezionati, tra cui il DM, lo scaffold sintetico di PLGA, ed espianti invecchiati di membrana di Bruch. Questa parte del progetto intendeva evidenziare le caratteristiche morfologiche e funzionali che si presentano nelle colture di cellule RPE quando vengono coltivate su substrati diversi. Abbiamo generato cellule RPE da una linea di hESC (H09) sottoposta a differenziazione spontanea. In una seconda parte dello studio, abbiamo utilizzato un protocollo di differenziazione diretta per accelerare ed aumentare l’efficacia di differenziazione. Per consentire l'esposizione della membrana basale dell'hAM, abbiamo dimostrato che la termolisina conserva meglio l'integrità del tessuto rispetto ad altri approcci di disepitelizzazione. Le cellule H09-RPE seminate su hAM de-epitelizzato non hanno formato un monostrato regolare di cellule RPE. I campioni di DM sono stati trattati con termolisina per consentire una corretta decellularizzazione. Le cellule H09-RPE sono state quindi seminate sul lato endoteliale della DM decellularizzata. Sulla nuova matrice, le cellule H09-RPE sono riuscite a formare un monostrato intatto di cellule con morfologia tipica RPE. Le linee cellulari di RPE derivate da pluripotenti hanno mostrato fenotipi diversi quando sono state coltivate sugli scaffold selezionati, supportando così l'ipotesi che l'ambiente in cui risiedono le cellule può influenzarne le caratteristiche morfologiche e funzionali. Quando sono stati trapiantati nello spazio sottoretinico di ratto, la DM e lo scaffold di PLGA sono stati entrambi ben tollerati e non sono stati osservati segni di rigetto. A differenza dello scaffold di PLGA, la DM non si è appiattita nello spazio sottoretinico. La manipolazione dell'hAM rimane una sfida significativa e abbiamo scoperto che la sua variabilità biologica influenza il successo della coltura di cellule RPE. D'altra parte, abbiamo inizialmente dimostrato che la DM acellulare era in grado di sostenere le cellule H09-RPE. Lo studio in vivo ha dimostrato che il naturale ripiegamento della DM impedisce di stabilire una coltura cellulare ottimale e di posizionare correttamente il foglietto cellulare quando viene impiantato. Non è stato osservato alcun segno di rigetto dopo il periodo di follow-up. Nel complesso, i nostri risultati scoraggiano l'uso della DM come strumento di ingegneria tissutale per il trapianto di retina. Tuttavia, la presenza di attributi intrinseci sulla superficie della DM utili a supportare la coltura in vitro di cellule RPE suggerisce l'uso di questa membrana come modello per futuri scaffold per l'ingegneria tissutale oculare.

Among the wide range of retinal degeneration disorders, age-related macular degeneration (AMD) is the most common cause of blindness in the Western world. The events occurring during the progression of the disease lead to retinal pigment epithelium (RPE) disruption and failure. Previous clinical studies suggest that RPE-cell replacement therapy may preserve vision and restore retinal function in AMD patients. New developments in the field of stem cells enabled the differentiation of RPE cells from pluripotent stem cells, thus ensuring a limitless source of RPE cells. Upon several approaches for delivering these cells in the back of the eye, scaffold-based methods are being tested in ongoing clinical trials. In this regard, borrowed materials from donor tissues can be used as cell supports in subretinal transplantation. We first focused on the human amniotic membrane (hAM). An alternative to hAM can be found within the eye: the Descemet’s membrane (DM). This study initially aimed to investigate human embryonic stem cell-derived RPE (hESC-RPE) cells survival and behaviour on de-epithelialized hAM and decellularized DM, which may be of clinical relevance in cell transplantation for AMD. We also sought to assess the in vivo integration of this membrane using rat animal model. Lastly, a comparative study was conducted between pluripotent-derived RPE cell cultures on different selected scaffolds including the DM, the synthetic poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold taken as a “gold standard” of RPE cell transplantation and aged explants of Bruch’s membrane. This part of the project intended to highlight morphological and functional features arising on RPE cell cultures when cultured on different substrates. We generated RPE cells from a hESC line (H09) subjected to spontaneous differentiation. In a second part of the study, we used a direct differentiation protocol to speed up and increase the rate of cell differentiation. To allow the exposure of the hAM’s basement membrane, we found that thermolysin provided better retention of tissue integrity compared to other de-epithelialization approaches. H09-RPE cells seeded over de-epithelialized hAM failed to organize into a regular monolayer of cells. Samples of DM were treated with thermolysin to allow proper decellularization. H09-RPE cells were then seeded onto the endothelial-side surface of the acellular DM. On the new matrix, H09-RPE cells succeeded in forming an intact monolayer of cells with RPE morphology. Pluripotent derived-RPE cell lines showed different phenotypes when cultured on the selected investigated scaffolds, thus supporting the hypothesis that the environment where the cells reside can affect the characteristics of the cells. When transplanted in the subretinal space of rats, the DM and the PLGA scaffolds were both well tolerated and no sign of rejection was observed up to two months after surgery. Unlike the PLGA scaffold, the DM was generally unable to flatten. The handling of the hAM remains a significant challenge and we found that the biological variability of the hAM affected the successful culturing of the H09-derived RPE cells. On the other hand, we initially showed that acellular DM was capable of sustaining H09-RPE cells, thus confirming to be potentially a valid alternative to the Bruch’s membrane. The in vivo study demonstrated that the natural folding of the DM prevents optimal cell culture to be established and proper positioning of the cell patch when implanted. Nonetheless, no sign of rejection was observed after the follow-up period, confirming the safety of the graft. Overall, our findings discourage the use of the DM as a tissue engineering tool for retinal transplantation. Nonetheless, the presence of intrinsic attributes on the DM surface could support in vitro pluripotent-derived RPE cell culture, thus suggesting the use of this membrane as a suitable template for future scaffolds for ocular tissue engineering.