Role of PML in NLRP3-Dependent Inflammation in Neurological Disorders

Il legame tra processi infiammatori e la progressione degli eventi neurodegenerativi è ben consolidato. L'epilessia, caratterizzata da crisi ricorrenti, presenta un'attività neuronale aberrante ed un elevato stato infiammatorio cerebrale. L'ictus ischemico si verifica a causa di un flusso sanguigno ridotto o interrotto in una parte del cervello, causando danni alle cellule cerebrali per mancanza di ossigeno e nutrienti. La neuroinfiammazione sostenuta contribuisce alla morte e alle lesioni cellulari dopo l'ictus. Di conseguenza, in condizioni quali epilessia e ictus ischemico, l'attivazione sostenuta del NLRP3-inflammasoma può peggiorare gli esiti. Date le scoperte del nostro laboratorio che dimostrano, in un contesto tumorigenico, che PML forma un complesso trimerico con P2X7 e NLRP3, portando all'inattivazione dell'inflammasoma NLRP3, questo studio mira a investigare il potenziale ruolo di PML sulla neuroinfiammazione dipendente da NLRP3 nelle malattie neurologiche. In base a questi risultati, il presente studio approfondisce l'interazione tra risposte infiammatorie e condizioni di danno neurologico. Abbiamo esaminato il coinvolgimento di PML nello stato infiammatorio dipendente da NLRP3, in particolare in modelli in vitro e in vivo di epilessia e ictus ischemico, utilizzando topi sia WT che geneticamente modificati privi della proteina PML. Abbiamo elaborato due protocolli per ottenere colture di singoli tipi di cellule cerebrali e popolazioni di tetra-coltura per valutare la principale popolazione cerebrale coinvolta nel rilascio di citochine pro-infiammatorie e le differenze nello stato infiammatorio tra le condizioni WT e PML-KO. I dati ottenuti dalle colture cellulari hanno mostrato che, in un modello generico in vitro di infiammazione, la microglia è la principale popolazione cerebrale coinvolta nel rilascio di citochine, con PML-KO che mostra uno stato infiammatorio aumentato rispetto alla condizione WT. Per studiare in vitro epilessia e ictus ischemico, abbiamo utilizzato tetra-colture cerebrali che comprendevano sia componenti gliali che neuronali. Dopo la somministrazione di KA e Glutammato per indurre un modello epilettico, abbiamo osservato un aumento significativo dello stato infiammatorio in PML-KO rispetto a WT. I livelli proteici elevati dell'inflammasoma NLRP3 nelle cellule PML-KO non trattate sottolineano la propensione di PML-KO a rilasciare citochine pro-infiammatorie. Estendendo ai modelli epilettici in vivo, i topi PML-KO mostrano una maggiore sensibilità alla somministrazione di KA, con un aumento della gravità delle crisi. Abbiamo esplorato il legame tra gliosi e uno stato infiammatorio attivato dipendente da NLRP3, notando uno stato di gliosi più pronunciato nei topi PML-KO e un aumento del rilascio di citochine rispetto a WT, suggerendo che l'assenza di neuroinfiammazione dipendente da PML possa svolgere un ruolo significativo nella fisiopatologia delle crisi indotte da KA. Per ricreare un modello ischemico in vitro, abbiamo esposto le colture cerebrali a OGD e riperfusione. L'assenza di PML ha comportato un rilascio sostenuto di IL-1β rispetto al WT, un'elevata espressione dei componenti dell'inflammasoma NLRP3 e livelli aumentati di marker di gliosi post-riperfusione. Inoltre, abbiamo osservato una diminuzione dei marker neuronali dopo 24 e 48 ore di riperfusione. Passando al modello murino in vivo tMCAO, i topi PML-KO hanno mostrato aree ischemiche più grandi e peggiori stati comportamentali, insieme a un rilascio prolungato di IL-1β rispetto ai corrispettivi WT. Questi risultati sottolineano il ruolo cruciale di PML nella modulazione dell'infiammazione guidata da NLRP3 nel SNC, influenzando significativamente gli esiti di epilessia e ictus ischemico. L'assenza di PML amplifica le risposte infiammatorie, peggiorando il danno neuronale e i deficit comportamentali. Questo studio getta luce sull'interazione complessa tra PML, l'inflammasoma NLRP3 e le patologie neurologiche.

The link between inflammatory processes and the progression of neurodegenerative events is well-established, emphasizing that inflammation is not merely a consequence but an active player in the pathology itself. Epilepsy, marked by recurrent, unprovoked seizures, involves not only aberrant neuronal activity but also a profound brain inflammatory environment. Ischemic stroke occurs from a reduced or interrupted blood flow to a part of the brain, leading to brain cells damage due to a lack of oxygen and nutrients. Sustained neuroinflammation contributes to cell death and injury after stroke. Thus, in conditions including Epilepsy and Ischemic stroke, the sustained NLRP3-inflammasome activation may drive chronic neuroinflammation exacerbating outcomes. Given our laboratory’s findings demonstrating, in a tumorigenic context, that PML forms a trimeric complex with P2X7 and NLRP3, leading to the inactivation of NLRP3 inflammasome, this study aims to investigate the potential role of PML on NLRP3-dependent inflammation in neurological diseases. According to these findings, the present study delves into the interplay between inflammatory responses and neurological damage conditions, focusing on NLRP3-dependent pathways and the intriguing influence of PML. We investigated the involvement of PML in the NLRP3-dependent inflammatory state, particularly in in vitro and in vivo models of Epilepsy and Ischemic stroke, using both WT and genetically modified mice lacking the PML protein. We devised two protocols to obtain single brain cell-type culture and tetra-culture brain cell populations to assess the main brain population involved in pro-inflammatory cytokine release and differences in inflammatory states between WT and PML-KO conditions. Data from single brain cell-type cultures showed that, in a generic in vitro inflammation model, microglia is the main brain population involved in cytokine release, with PML-KO demonstrating increased inflammatory status compared to WT. To study in vitro Epilepsy and Ischemic stroke, we adopted the brain tetra-culture population approach to model both glial and neuronal components. Following KA and Glutamate administration to induce an epileptic model, we found a significant increase in inflammatory status in PML-KO compared to WT. Elevated protein levels of the NLRP3 inflammasome in untreated PML-KO cells underscore the propensity of PML-KO to release pro-inflammatory cytokines. Extending to in vivo epileptic models, PML-KO mice display heightened sensitivity to KA administration, resulting in increased seizure severity. We explored the link between gliosis and an activated NLRP3-dependent inflammatory state, noting a more pronounced gliosis state in PML-KO mice and increased cytokine release compared to WT, suggesting the absence of PML-dependent neuroinflammation may play a significant role in the pathophysiology of KA-induced seizures. To recreate an in vitro ischemic model, we exposed tetra-culture brain cells to OGD and reperfusion. Interestingly, PML absence resulted in sustained IL-1β release compared to WT, elevated expression of NLRP3 inflammasome components, and increased gliosis marker levels post-reperfusion. Additionally, we noted decreased neuronal markers after 24 and 48 h of reperfusion. Moving to the in vivo tMCAO mouse model, PML-KO mice displayed larger ischemic areas and worse behavioral states, alongside prolonged IL-1β release compared to WT counterparts. These findings underscore PML's pivotal role in modulating NLRP3-driven inflammation in the CNS, thus significantly influencing Epilepsy and Ischemic stroke outcomes. PML absence amplifies inflammatory responses, worsening neuronal damage and behavioral deficits. This study sheds light on the intricate interplay among PML, the NLRP3 inflammasome, and neurological disorders. Undoubtedly, unraveling the molecular mechanisms behind these pathologies helps to identify innovative intervention strategies.