Ferroptosis involvement in Rett syndrome pathophysiology

La sindrome di Rett (RTT) è una malattia genetica rara del neurosviluppo che colpisce prevalentemente bambine con un’incidenza di 1:10000 nascite. Nel 95% dei casi questa malattia, che rappresenta la seconda causa di ritardo mentale dopo la Sindrome di Down, è dovuta ad una mutazione del gene MECP2 situato nel cromosoma X, il quale codifica per la proteina methlyl-CpG binding protein 2 (MeCP2). Questo gene, fondamentale per il neurosviluppo, è considerato un importante regolatore epigenetico in grado di promuovere o reprimere la trascrizione di numerosi altri geni. La letteratura scientifica sembra evidenziare sempre più un coinvolgimento della morte ferroptotica in diverse patologie, non solo neurodegenerative come il Parkinson e Alzheimer, ma anche in malattie del neurosviluppo, come l’autismo. La ferroptosi è una forma di morte cellulare ferro-dipendente caratterizzata dall'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), di perossidi lipidici e dalla deplezione degli acidi grassi polinsaturi delle membrane cellulari. Poiché diverse alterazioni molecolari che contraddistinguono la sindrome di RTT sono coerenti con diversi aspetti che caratterizzano la ferroptosi, come uno squilibrio redox, un aumento della produzione di ROS, un eccesso di ferro libero, un aumento dei livelli di perossidazione lipidica, una diminuzione dei livelli di glutatione ridotto e uno sbilanciamento dell’attività di enzimi antiossidanti, abbiamo deciso di indagare il possibile coinvolgimento di questa forma di morte cellulare nella patologia RTT. A questo scopo, fibroblasti primari umani ottenuti da soggetti sani e da pazienti RTT sono stati trattati con due induttori di morte ferroptotica, erastina e RSL3. In aggiunta, topi femmina eterozigoti Mecp2tm1.1Bird/+ di 8 o 24 settimane di età sono stati utilizzati al fine di valutare possibili differenze di espressione delle principali molecole coinvolte nel processo ferroptotico. I risultati ottenuti hanno dimostrato un aumento dei livelli di perossidazione lipidica e una maggiore produzione di ROS mitocondriali nelle cellule RTT, processi che sembrano importanti nel guidare questa morte cellulare. I fibroblasti RTT presentano un'alterazione del metabolismo del ferro, probabilmente dovuto ad un maggiore attivazione del processo di ferritinofagia. Inoltre, il trattamento con induttori della ferroptosi peggiora drasticamente questo squilibrio già di per sé presente nella RTT rispetto ai controlli. Al contrario, invece, il trattamento con composti che mimano l’attività di enzimi antiossidanti come la Ferrostatina-1 e mito-TEMPO, non solo previene gli effetti degli induttori di morte ferroptotica, ma apporta anche un miglioramento della condizione basale, già alterata di per sé nelle cellule RTT. Inoltre, uno squilibrio della risposta antiossidante è stato riscontrato nei fibroblasti RTT rispetto ai controlli, specialmente in seguito agli stimoli ferroptotici. In conclusione, i risultati ottenuti sembrano dimostrare uno sbilanciamento generale nella RTT di diversi fattori coinvolti nel processo ferroptotico, un fenomeno che può contribuire ad una maggiore suscettibilità alla morte cellulare ferroptotica che, conseguentemente, può giocare un ruolo nella fisiopatologia e nella progressione della sindrome di RTT.

Rett Syndrome (RTT) is a rare neurodevelopmental disorder affecting mainly girls with an incidence of 1:10000 live births. In 95% of the cases, this disorder, which constitutes the second leading cause of cognitive delay after Down syndrome, is due to a mutation in the X-linked gene MECP2, encoding for the methlyl-CpG binding protein 2 (MeCP2). This gene, fundamental in the neurodevelopmental process, is an important epigenetic regulator, able to promote or repress the transcription of several genes. Growing evidence from literature highlight the involvement of ferroptotic cell death in the pathophysiology of several neurodegenerative diseases, such as Parkinson’s disease and Alzheimer’s disease, and more interestingly in neurodevelopmental disorders such as autism. Ferroptosis is an iron-dependent form of cell death characterized by an accumulation of reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxides, and the depletion of the polyunsaturated fatty acids in cell membranes. Since several hallmarks of RTT are consistent with different aspects that characterize ferroptosis, such as an imbalance in the redox homeostasis, an excess of free labile iron, an increase in lipid peroxidation levels and a decreased in reduced glutathione levels, along with impaired activity of antioxidant enzymes, we decided to investigate the possible involvement of this form of cell death in the pathophysiology of RTT. With this purpose, we used human primary fibroblasts obtained from healthy and RTT patients treated with two ferroptosis inducers, i.e., erastin and RSL3. In addition, to evaluate possible differences in the expression of major molecules involved in the ferroptotic process between pre-symptomatic and symptomatic phase of RTT, heterozygous Mecp2tm1.1Bird/+ female mice of 8 and 22 weeks of age were used. Our findings demonstrated that RTT cells are characterized by increased levels of lipid peroxidation, high mitochondrial ROS production, which seems to exert a key role in driving the ferroptosis cell death, together with a more marked alteration of the iron metabolism probably related to a higher ferritinophagy process. In addition, the treatment with ferroptosis inducers worsens the redox imbalance in RTT cells more than in controls. On the other hand, treatment with ferroptosis inhibitor and a SOD mimetic such as Ferrostatin-1 and mito-TEMPO, respectively, prevents these effects and rescues the altered basal conditions of RTT cells. Simultaneously, an imbalance of antioxidant defense response was found in RTT fibroblasts, especially following ferroptotic stimuli. In conclusion, these results demonstrate in RTT cells a general dysregulation of several aspects whose alteration may contribute to an increased sensitivity to ferroptosis. Taken together, this evidence would therefore suggest a role for this cell death in the pathophysiology and progression of Rett syndrome.