Evaluation of new prognostic tools for neuroendocrine tumors: from clinical scores to genetic profiling

Introduzione Gli strumenti attualmente disponibili per definire la prognosi dei tumori neuroendocrini (NET) sono insufficienti. I punteggi NEPD e NEP sono stati proposti come strumenti prognostici facilmente derivabili rispettivamente dai dati clinici noti alla diagnosi e dopo almeno 24 mesi di follow-up. Il sequenziamento del DNA circolante su biopsia liquida (LB) è stato suggerito come alternativa meno invasiva al sequenziamento su biopsia solida (SB). Obiettivi AIM 1: verificare l’applicabilità di NEP e NEPD in una coorte di carcinoidi bronchiali (BCs, C1). AIM2: verificare l’applicabilità di NEP e NEPD in una seconda coorte di BCs (C2) e nell’intera popolazione di BCs (C1+2); esplorare il background genetico della C2, correlando il profilo clinico con quello mutazionale. AIM 3: valutare l’affidabilità del sequenziamento su LB rispetto a quello su SB in una coorte di NET gastro-entero-pancreatici (GEP NET, C3). Metodi Analisi retrospettiva e calcolo dei punteggi NEP e NEPD per ogni paziente (pt) BCs; identificazione di un cut-off predittivo di sopravvivenza (AIM 1 e 2). Estrazione del DNA dai campioni tumorali della C2, sequenziamento NGS di un pannello di 11 geni (MEN1, DAXX, ATRX, MUTYH, SETD2, DEPDC5, TSC2, ARID1A, CHECK2, MTOR, PTEN) e correlazione con il profilo clinico (AIM2). Estrazione del DNA dalle SB e LB derivate contemporaneamente dai pt della C3. Sequenziamento NGS del pannello di 11 geni precedentemente descritto e analisi comparativa (AIM3). Risultati AIM1: La C1 (26F, 17M; età mediana 63 anni) include 7 carcinoidi atipici (ABC) e 34 tipici (TBC) (due pt con dati mancanti). NEP e NEPD sono minori nei pt viventi all’ultimo follow-up (p<0.05). Punteggi NEP≥ 130 e NEPD≥ 112 sono predittivi di sopravvivenza (p<0.05), mentre il sesso maschile è un fattore prognostico negativo. AIM2: La C1+2 (48F, 30M) include rispettivamente il 75% e il 25% di TBC e ABC. NEP e NEPD sono minori nei pt viventi all’ultimo follow-up (p<0.05). Un cut-off ≥ 130 per entrambi i punteggi è predittivo di sopravvivenza (p<0.05), mentre il sesso maschile si conferma un fattore prognostico negativo. L’analisi NGS della C2 (24F, 14M; età mediana 49 anni) descrive 259 mutazioni (mut). Il numero medio di mut per pt è 4 (range 3-7). Prevalgono le varianti a singolo nucleotide, in particolare le transizioni (C>T and T>C). I TBC mostrano 174 mut (mediana=6.96), gli ABC 85 mut (mediana=6.53); PTEN e MEN1 sono mutati in tutti i TBC. Tutti gli ABC presentano alterazioni dei geni PTEN, MEN1 e SETD2. Il carico mutazionale è 0.11-0.25 e 0.11-0.19 mut/Mb nei TBC e ABC, rispettivamente. Lo studio gerarchico mostra una connessione tra pattern genetico e outcome clinico definito dal NEPD. AIM3: La C3 (M:F=2:1) include 3 NET pancreatici e 3 NET ileali, età mediana 64 anni. L’analisi NGS rivela un numero mediano di varianti/campione di 55 (LB) e 66.5 (SB), ed un carico mutazionale di 0.3-1.8 e 0.2-1.9 mut/Mb rispettivamente. Le mut missenso e nonsenso prevalgono, con una maggior frequenza di transizioni C>T. I geni sempre coinvolti sono ARID1A, MTOR, e ATRX nelle SB (100%) e ARID1A, TSC2, MEN1, PTEN, SETD2, e MUTYH nelle LB (100%). DAXX non è mai risultato mutato nelle LB. Le SB e LB condividono 17 mut ricorrenti; MTOR SNVs c.G4731A e c.C2997T sono condivise da 5 pt. Lo studio gerarchico ha rilevato differenti pattern di clustering, suggerendo un certo grado di somiglianza genetica. Conclusioni Confermiamo il valore prognostico del NEPD-score nei BC. L’indagine mutazionale supporta il ruolo chiave di MEN1 nella patogenesi di tali neoplasie. Ulteriori studi sono necessari al fine di studiare il ruolo del prodotto proteico derivato dai geni mutati nella patogenesi tumorale. I nostri risultati suggeriscono l’applicabilità della LB per il sequenziamento genico dei GEP-NET. Ulteriori studi su coorti più ampie aiuteranno a meglio definirne l'impatto clinico.

Introduction Available prognostic tests for neuroendocrine tumors (NET) are inadequate. NEPD and NEP-score are suggested as prognostic tools that can be simply calculated from accessible clinical data at diagnosis and after at least 24 months of follow-up, respectively. Genetic profiles obtained by sequencing circulating tumor DNA from liquid biopsy (LB) has been proposed as a less invasive alternative to solid biopsy (SB) sequencing. Aims AIM1: applicability of NEP and NEPD-score in a cohort of bronchial carcinoids (BCs, Cohort 1). AIM2: applicability of NEP and NEPD-score in a second cohort of BCs (Cohort 2) and in the whole BC population (Cohort 1+2); exploring the genetic background of Cohort 2 and correlate mutational and clinical profiles. AIM3: comparing LB and SB mutational profile in a cohort of gastro-entero pancreatic NET (GEP-NET, Cohort 3). Methods Retrospective data collection and calculation of NEP and NEPD-scores for each BCs patients (pts); identification of a threshold value able to predict survival outcomes (AIM 1 and 2). DNA extraction from Cohort 2 tumor samples, NGS sequencing of 11 genes (MEN1, DAXX, ATRX, MUTYH, SETD2, DEPDC5, TSC2, ARID1A, CHECK2, MTOR, PTEN) and correlation with pts clinical profiles (AIM 2). SB and LB were derived simultaneously from Cohort 3 and DNA was extracted. A comparative targeted NGS analysis was performed to evaluate the mutational status of the 11 gene panel mentioned above (AIM 3). Results AIM1: Cohort 1 (26 females,17 males; median age 63 yrs) included 7 atypical BCs (ABC) and 34 typical BCs (TBC) (two missing data). Median NEP and NEPD-score were lower in live pts at the end of follow-up (p<0.05). NEP-score ≥ 130 and NEPD-score ≥ 112 predict survival (p<0.05). Male gender was an adverse prognostic factor for survival. AIM2: Cohort 1+2 (48 females and 30 males) included 75% and 25% of TBC and ABC, respectively. Median NEP and NEPD-score were lower in live patients at the end of follow-up (p<0.05). A threshold ≥ 130 for both scores predicted survival (p<0.05). Male gender was confirmed as an adverse prognostic factor for survival. NGS analysis on Cohort 2 (14 males, 24 females; median age 49 yrs) revealed 259 mutations (muts). Median number of muts per pts was 4 (range 3-7). Single nucleotide variants were prevalent and mainly transition muts (C>T and T>C). TBC showed 174 muts (median= 6.96), and ABC had 85 muts (median= 6.53); PTEN and MEN1 were mutated in all TBC pts. All ABC pts presented PTEN, MEN1, and SETD2 genes alterations. Mutational burden was 0.11-0.25 and 0.11-0.19 muts /Mb in TBC and ABC, respectively. Hierarchical studies highlighted a connection between genetic patterns and clinical outcomes measured as NEPD-score. AIM3: Cohort 3 (M:F=2:1) included 3 pancreatic and 3 ileum NETs with a median age of 64 years. NGS analysis detected a median number of variants/sample of 55 (LB) and 66.5 (SB), with a mutational burden of 0.3-1.8 and 0.2-1.9 muts /Mb, respectively. Missense and nonsense muts were prevalent in both, with a greater rate of C>T transitions. The genes involved were ARID1A, MTOR, and ATRX in SB (100%) and ARID1A, TSC2, MEN1, PTEN, SETD2, and MUTYH in LB (100%). DAXX was utterly absent in LB. Seventeen recurrent muts were shared between SB and LB; in particular, MTOR SNVs c.G4731A and c.C2997T were shared by 5 out of 6 pts. Hierarchical clustering revealed distinct clustering patterns supporting genetic similarity. Conclusions NEPD-score was confirmed as a promising prognostic tool in predicting BC behavior since diagnosis. Mutational evaluation supports the central role of MEN1 in BCs. Future studies investigating the involvement of mutated gene protein products are needed. We suggest the applicability of LB in the genetic profile of GEP-NET. Further studies with larger cohorts are needed to define its clinical impact.