Regenerative Medicine: Multiple Approaches for Innovative Therapies Development

Questa tesi è il risultato di un dottorato in "Medicina Molecolare" frequentato presso il "Laboratorio di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa" guidato dalla Prof.ssa Barbara Zavan. Durante questi tre anni di dottorato, la ricerca è stata focalizzata sul campo della medicina rigenerativa con lo scopo di scoprire molteplici approcci per lo sviluppo di terapie innovative appropriate per diverse patologie. Per raggiungere questo obiettivo, sono riportate nella presente tesi, due diverse strategie al fine di trovare terapie innovative. Il primo capitolo è mirato ad esplorare l'uso potenziale di Piccole Vescicole Extracellulari (sEVs) come trattamento innovativo nel campo delle Malattie Cardiovascolari (CVDs), che ancora rappresentano un problema per la salute a livello mondiale, rimanendo una delle principali cause di morte. Per realizzare ciò, le Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) sono state esposte a condizioni di ipossia, poiché è riportato in letteratura scientifica, che quando sottoposte a questa condizione, sono in grado di produrre mediatori capaci di migliorare e aumentare un effetto rigenerativo, agendo su processi biologici che inducono la rigenerazione tissutale. Tra questi mediatori, le sEVs derivate dalle MSCs, hanno suscitato un crescente interesse come possibile nuovo agente terapeutico per un trattamento innovativo per diverse CVDs. Per questo motivo, le sEVs derivate da MSCs sottoposte ad ipossia indotta da un trattamento con mesilato di deferoxamina (DFO), sono state investigate come possibile terapia, utilizzandole come trattamento su cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVECs). L'effetto su queste cellule, è stato poi studiato eseguendo un'analisi del potenziale di membrana mitocondriale e un'analisi trascrittomica completa tramite sequenziamento dell'RNA delle HUVEC e sequenziamento del contenuto in miRNA delle sEVs prodotte dalle stesse HUVEC. Sulla base dei dati ottenuti in questo primo capitolo, è stato possibile affermare che le cellule mesenchimali trattate con DFO, rilascino sEVs in grado di indurre nelle cellule endoteliali riceventi, vie molecolari e processi biologici, coinvolti anche nella proliferazione e nell’angiogenesi, consentendo di ipotizzare un utilizzo delle sEVs derivate da MSCs sottoposte ad ipossia come terapia potenziale per le CVDs. Il secondo capitolo invece, mira a presentare un approccio fisico non invasivo, studiando l'effetto di campi magnetici complessi (CMFs) su colture di fibroblasti e macrofagi derivati da pazienti diabetici, affetti da ulcere del piede diabetico (DFUs). Ad oggi, è ben noto che il diabete mellito (DM) è definito come un disturbo metabolico cronico, caratterizzato da un'ipercolesterolemia persistente. Questa condizione cronica di ipercolesterolemia, in sinergia con altre aberrazioni metaboliche nei pazienti con DM, può indurre danni a vari sistemi organici e tessuti, promuovendo lo sviluppo di complicanze sanitarie disabilitanti e potenzialmente letali, tra le quali spiccano le complicanze macrovascolari che portano ad aumentare il rischio di 2-4 volte, di sviluppare malattie cardiovascolari e anche danni tissutali come le ulcere del piede diabetico (DFU). In questo contesto, per studiare l'effetto dei CMFs sulle cellule derivate da pazienti diabetici, è stata valutata la loro capacità di influenzare la produzione di ROS e il loro effetto sulle proprietà e sui processi di guarigione delle ferite su queste cellule selezionate. In particolare, sono state eseguite analisi relativamente la produzione di ROS, analisi del potenziale di membrana mitocondriale, osservazione morfologica mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e sequenziamento dell'RNA delle colture di fibroblasti e monociti dei pazienti diabetici. Osservando i dati raccolti nel secondo capitolo, si evidenzia il potenziale benefico del trattamento con CMF per i pazienti diabetici che sviluppano le ulcere del piede diabetico.

This thesis is the result of a PhD in “Molecular Medicine” attended in “Tissue Engineering and Regenerative Medicine laboratory” leaded by Prof. Barbara Zavan. During these three years of PhD the research was focused on regenerative medicine field with the purpose to discovery multiple approaches for innovative therapies development appropriate for different pathologies. To achieve this goal, two different strategies in order to find innovative therapies, are offered in this thesis. The first Chapter, is aimed to explore the potential use of Small Extracellular Vesicles (sEVs) as innovative treatment in the Cardiovascular Diseases (CVDs) field that still represents a major health concern worldwide remaining one of the main causes of death globally. In order to realize that, Mesenchimal Stem Cells (MSCs) has been exposed to hypoxia condition, since it is reported in scientific literature that MSCs subjected to hypoxia, are able to produce mediators capable to improve and increase a regenerative effect, acting on biological processes that induce tissue regeneration. Among these mediators, Small Extracellular Vesicles (sEVs) derived from MSCs, have attracted growing interest as a possible novel therapeutic agent for an innovative treatment for different CVDs. For this reason, sEVs-derived from MSC under hypoxia induced by an iron-chelating deferoxamine mesylate (DFO) treatment, were investigated as possible therapy, being used as treatment on Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The effect on these cells was then investigated performing mitochondria membrane potential analysis and a complete transcriptomic analysis by Illumina RNA sequencing of the HUVEC and HUVEC sEVs-derived miRNA-content sequencing. Taking together all the data obtained in this first chapter, allowed to assume that mesenchymal cells treated with DFO release sEVs that are able to induce in the recipient endothelial cells molecular pathways and biological processes involved in the proliferation and angiogenesis too, allowing to envision a possible use of under hypoxia MSC sEVs derived as potential therapy on CVDs. The second Chapter instead, is aimed to present a physical non-invasive approach, studying the effect of complex magnetic fields (CMFs) on fibroblasts and monocyte cultures (subsequently differentiated in macrophages) derived from diabetic patients, affected by diabetic foot ulcers (DFUs). To date it is well known that Diabetes mellitus (DM) is defined as a chronic metabolic disorder, characterized by a persistent hyperglycemia. This chronic hyperglycemia condition, in synergy with other metabolic aberrations in patients with DM can induce damage to various organ systems and tissues, promoting the development of disabling and life-threatening health complications, most prominent of which are microvascular such as retinopathy, nephropathy, and neuropathy and macrovascular complications leading to a 2-fold to 4-fold increased risk of cardiovascular diseases and even tissue damages like inducing the diabetic foot ulcers (DFU). In this view, to study the effect of CMFs on diabetes patients cells-derived, their capacity to influence the ROS production and their effect on wound healing properties and processes on these selected cells was evaluated. In particular, ROS production analysis, mitochondria membrane potential analysis, morphology observation using scanning electron microscopy (SEM) and Illumina RNA sequencing analysis of fibroblast and monocyte cultures from diabetic patients were performed. Taking together, all the data collected in the second chapter highlight the beneficial potential of CMF treatment for diabetic patients that develop diabetic foot.