New anti-inflammatory agents targeting Nuclear Factor kappa B (NF-kB) in the treatment of Cystic Fibrosis

Patologie con caratteristiche cliniche differenti, come la fibrosi cistica (FC), principale oggetto di studio di questo lavoro, le malattie intestinali infiammatorie (IBD), ed altre patologie condividono lo stesso rischio di sviluppare uno stato infiammatorio cronico, controllato dal fattore di trascrizione NF-kB. I trattamenti principali per i pazienti con FC e IBD mirano a sopprimere o attenuare i sintomi cercando di ridurre l’infiammazione cronica utilizzando farmaci prevalentemente nella fase acuta o associati ad importanti effetti collaterali in cronico. Nasce pertanto la necessità di sviluppare nuovi metodi terapeutici in grado di ridurre l’eccessiva infiammazione. Poiché NF-kB gioca un ruolo critico nell’espressione di IL-8, l’uso di agenti in grado di interferire con il pathway di NF-kB rappresenta un’interessante strategia terapeutica. La 4,6,4’-trimetilangelicina (TMA), studiata da anni presso i nostri laboratori di ricerca, si è rilevata un potente agente antiinfiammatorio ed un interessante modulatore del CFTR. Sfortunatamente, la stessa TMA ha mostrato effetti mutageni e fototossici non compatibili con l’utilizzo in clinica. L'obiettivo principale è stato lo sviluppo di nuovi agenti antiinfiammatori per il trattamento della FC con effetti collaterali ridotti o possibilmente assenti, utili anche in combinazione con farmaci antimicrobici allo scopo di contrastare l’infiammazione polmonare, riconosciuta come il principale fattore nella patogenesi delle malattie polmonari nella FC. Nello specifico, sono state indagate le attività biologiche di una nuova serie di derivati della TMA e dell’ibuprofene, rispettivamente sintetizzati chimicamente ed enzimaticamente per migliorare l’attività antiinfiammatoria degli scaffold e ridurre gli effetti collaterali. Attraverso saggi EMSA preliminari, sono stati identificati diversi derivati della TMA di nuova generazione che preservano l’attività inibitoria nei confronti della formazione del complesso NF-kB/DNA. I composti più attivi selezionati sono stati testati nel modello di cellule fibrocistiche bronchiali IB3-1 (F508del/W1282X) infettate da Pseudomonas aeruginosa (PAO-1) per studiare la modulazione di IL-8 mediante RT-qPCR ed ELISA. Da questi risultati è emerso che i derivati GY971a e GY964 sono i due analoghi di TMA migliori nel ridurre l’espressione genica di IL-8 nelle cellule IB3-1 infettate da PAO-1, da soli o in combinazione con agenti antimicrobici di comune utilizzo nei trattamenti per la FC. GY971a e GY964 confermano la loro attività anche in cellule IB3-1 stimolate con TNF- e nello stesso modello infiammatorio è stato dimostrato che l’azione antiinfiammatoria dell’ibuprofene viene mantenuta dai suoi derivati e, in alcuni casi, sembra aumentare. I derivati della TMA hanno mantenuto una lieve attività di modulazione di CFTR, dimostrando effetti sinergici con i modulatori testati sulla linea cellulare CFBE41o- (F508del/F508del). Successivamente è stata studiata l’attività dei derivati psoralenici in un nuovo modello cellulare di infiammazione intestinale, rappresentato da cellule umane tumorali di colon stimolate con lo stimolo TNF-. Questa analisi ha permesso il rafforzamento dei risultati ottenuti con l’analogo di TMA più promettente (GY971a). Parallelamente, è stata studiata la citotossicità in vitro dei derivati della TMA e dell’ibuprofene. I composti hanno mostrato caratteristiche interessanti essendo privi di effetti mutageni, fototossici e pro-apoptotici. Infine, tutti gli esperimenti condotti in vivo (C57Bl/6NCr) hanno confermato l’effetto antiinfiammatorio principalmente di GY971a abbassando la carica batterica e la conta dei neutrofili nel liquido di lavaggio bronco-alveolare murino e nei polmoni. Pertanto, questi risultati hanno fornito una chiara indicazione: GY971a sembra essere un derivato della TMA molto interessante alla luce degli studi preclinici condotti.

Pathologies with distinctive clinical features, such as Cystic Fibrosis (CF), which is the main objective of this work, Intestinal Bowel Diseases (IBDs), and other pathologies share the risk of developing a significant chronic inflammatory state, which is controlled by NF-kB transcription factor (TF), crucial for the worsening of the diseases. The primary treatments for CF and IBDs focus on symptom relief trying to reduce chronic inflammation exploiting drugs used mainly in the acute phase or that are associated with side effects in chronic. Therefore, rose the necessity to develop new therapeutic methods that can reduce the excessive inflammation. Since the TF NF-kB plays a critical role in the IL-8 expression, the use of agents able to interfere with the NF-kB pathway represents an interesting therapeutic strategy. The 4,6,4’-trimethyl angelicin (TMA), studied for a long time in our research laboratories, has proven to be a potent anti-inflammatory agent at nanomolar concentrations and to be an interesting CFTR modulator. Unfortunately, TMA itself demonstrated mutagenic and phototoxic effects not compatible with clinical uses. The main objective of this research work was the development of new anti-inflammatory agents for the treatment of CF with reduced or possibly absent side effects, useful also in combination with antimicrobial agents aimed at combating the pulmonary inflammation, recognized as the major factor in the pathogenesis of lung diseases in CF. In detail, we investigated the biological activities of a new series of TMA and ibuprofen derivatives, which were respectively chemically and enzymatically synthesized to improve the scaffolds anti-inflammatory activity and to reduce side effects. Through preliminary EMSA experiments, we identified several new generation TMA derivatives preserving the activity in inhibiting the formation of NF-kB/DNA complex. The chosen most active compounds were tested in Pseudomonas aeruginosa strain (PAO-1) infected bronchial fibrocystic cell line model IB3-1 (F508del/W1282X) to investigate the IL-8 by RT-qPCR and ELISA. From these results it emerged that GY971a and GY964 derivatives were the two TMA analogs with the best ability to significantly downregulate the gene expression of IL-8 in PAO-1 infected IB3-1 (F508del/W1282X) cells, alone or in combination with common antimicrobial agents used in CF treatments. GY971a and GY964 confirm their activity also in TNF- stimulated IB3-1 cells and in the same inflammation model has been demonstrated that ibuprofen’s anti-inflammatory action is maintained by the derivatives, and in some cases, it seems to increase. TMA derivatives maintained a slight CFTR modulatory activity, leading to synergic effects with the modulators tested on the cell line CFBE41o- (F50del/F508del). Subsequently, we studied the psoralens derivatives activities in a new intestinal inflammatory cell model, represented by colon cancer cells inflamed with the stimulus TNF-. This analysis led us to strengthen the results we obtained for the most promising TMA analog (GY971a). Collected these results, we investigated the in vitro the biological activity of TMA and ibuprofen derivatives. The compounds showed very interesting features being no mutagenic, no phototoxic and no pro-apoptotic agents. In the end, all the conducted experiments confirmed the anti-inflammatory effect mainly of GY971a in vivo (C57Bl/6NCr mice) by lowering the bacterial load and neutrophils count in the murine Bronco-alveolar lavage fluid and lungs. Therefore, these outcomes gave a clear indication: GY971a seems to be a very interesting TMA derivative in our pre-clinical studies.