New target for the development of antimigraine drugs: in vitro and in vivo study

L'emicrania è caratterizzata da attacchi dolorosi della durata di 4-72 ore, che colpisce il 12% della popolazione con un impatto importante sul benessere e la qualità della vita. La fisiopatologia dell'emicrania è molto complessa. L'emicrania può essere trattata da diverse classi di farmaci, appartenenti a due macro-categorie: terapia sintomatica e preventiva, ma la maggior parte di queste terapie sono mal tollerate o inefficaci, ed un elevato numero di pazienti sono insoddisfatti del loro trattamento, mentre altri la sviluppano in seguito ad abuso di farmaci sintomatici. Da qui la necessità di individuare nuovi obiettivi terapeutici per lo sviluppo di nuovi farmaci. L'obiettivo generale di questo lavoro di ricerca è stato lo studio farmacologico in vitro o in vivo di composti nuovi e standard che agiscono su diversi recettori coinvolti nella malattia dell'emicrania, nello specifico: 1) la messa a punto in vitro e la validazione di una serie di saggi per la caratterizzazione farmacologica di ligandi del recettore kappa; 2) sintesi e caratterizzazione farmacologica di ligandi peptidici, agonisti misti, per i recettori NOP/oppioidi; 3) progettazione, sintesi e caratterizzazione farmacologica di nuovi antagonisti TRPA1, analoghi di DHC200; 4) la valutazione del cannabidiolo (CBD) in vivo, in un modello murino di emicrania indotta dalla somministrazione sistemica del peptide correlato al gene calcitonina (CGRP); 5) la valutazione del ruolo svolto dal recettore per la nocicettina/orfanina FQ (NOP) nell’ emicrania tramite lo studio del fenotipo di topi knockout per il recettore NOP (NOP(-/-)) in due modelli sperimentali di emicrania. I risultati ottenuti sono: 1) messa a punto con successo e convalidazione farmacologica di una serie di test in vitro per caratterizzare i ligandi per il recettore kappa. Due nuovi derivati di dinorfina A sono stati caratterizzati: PWT2-Dyn A e Dyn A-palmitico. Questi composti si sono comportati come potenti agonisti per il recettore kappa; 2) 31 nuovi composti con sequenza generale [Tyr/Dmt1Xaa5]N/OFQ(1-13)NH2 sono stati sintetizzati e studiati attraverso il saggio della mobilizzazione del calcio intracellulare e tramite analisi DMR, utilizzando cellule che esprimono stabilmente i recettori oppioidi. [Dmt1,5]N/OFQ(1-13)-NH2 è stato identificato come l'agonista peptidico misto NOP/mu più potente finora descritto. Questo è un peptide promettente da testare in vivo nei modelli di emicrania preclinica; iii) DHC236 e DHC277 sono stati identificati come antagonisti TRPA1 puri e potenti, tre volte più potenti del composto di partenza DHC200. Si tratta di ligandi promettenti da testare in vivo in modelli di emicrania preclinica; iv) una singola somministrazione acuta di CGRP induce segni di ipersensibilità facciale sia nei topi femmine che in maschi, mentre il trattamento ripetuto di CGRP ha prodotto una progressiva diminuzione dell’allodinia periorbitale in topi femmine, mimando la progressione ad una fase cronica dell'emicrania. La somministrazione di CBD ha protetto sia le femmine che i maschi dall'insorgenza di allodinia periorbitale indotta da una singola iniezione di CGRP, mentre CBD cronico ha impedito lo sviluppo di allodina basale nelle femmine. Inoltre, il CBD iniettato dopo CGRP, ha revertito l'allodina evocata da CGRP ed ha anche ridotto i segni di dolore spontaneo indotti dalla somministrazione di CGRP nelle femmine. CBD ha bloccato l'ansia indotta da CGRP nei maschi, ma non è riuscito a revertire la fotofobia indotta da CGRP nelle femmine; v) Topi CD-1 sia maschi che femmine knock-out per il recettore NOP si sono dimostrati più sensibili sia agli effetti di NTG che di CGRP quando confrontati con CD-1 sia maschi che femmine wild-type, suggerendo che il ruolo nell’insorgenza dell’emicrania del recettore NOP. Concludendo, questo lavoro ha permesso lo sviluppo di nuove tecniche e composti per accelerare l'identificazione e lo sviluppo di nuovi farmaci anti-emicrania.

Migraine is a recurrent headache disorder typified by painful attacks lasting 4 to 72 hours, which affects 12% of the Caucasian population and has a major impact on the well-being and quality of life of patients and their families. Migraine can be treated by different classes of drugs, belonging to two macro-categories: symptomatic and preventive therapy, but most of these therapies are poorly tolerated or ineffective, and a large number of patients are dissatisfied with their treatment, while others develop it following the abuse of symptomatic drugs. Hence the need to identify new therapeutic targets for the development of new anti-migraine drugs. The general aim of this research work has been the in vitro or the in vivo pharmacological investigation of new and standard compounds acting on different receptors involved in migraine disease. The aims of the study were: 1) the in vitro set-up and pharmacological validation of a battery of assays for the pharmacological characterization of kappa opioid receptor ligands; 2) the design, synthesis, and pharmacological characterization of mixed NOP/opioid peptide agonists; 3) the design, synthesis, and pharmacological characterization of new TRPA1 antagonists, analogs of the standard antagonist DHC200; 4) the evaluation of cannabidiol (CBD) in vivo, in a mouse model of migraine induced by calcitonin gene-related peptide (CGRP) systemic administration; 5) the evaluation of the role played by the NOP receptor in migraine by studying the phenotype of mice knockout for the NOP receptor (NOP(-/-)) in two experimental migraine models (nitroglycerin (GTN)-induced migraine and CGRP-induced migraine). The main results can be resumed as follow: 1) a platform of in vitro assays to characterize ligands for the kappa opioid receptors have been successfully set up and pharmacologically validated using a panel of standard kappa ligands. In the frame of this study, two new dynorphins A derivatives have been characterized: PWT2-Dyn A and Dyn A-palmitic. These compounds behaved as potent full kappa agonists; 2) 31 new compounds with the general sequence [Tyr/Dmt1Xaa5]N/OFQ(1-13)NH2 have been synthesized and investigated through the calcium mobilization and the DMR assays, using cells stably expressing the NOP, mu, delta, and kappa receptors. [Dmt1,5]N/OFQ(1-13)-NH2 was identified as the most potent mixed NOP/mu peptide agonist so far described. This is a promising peptide to test in in vivo in pre-clinical migraine models; 3) DHC236 and DHC277 were identified as pure and potent TRPA1 antagonists, three times more potent than the starting compound DHC200. These are promising ligands to test in in vivo in pre-clinical migraine models; 4) a single administration of CGRP induced facial hypersensitivity in both female and male mice, while repeated CGRP treatment produced progressively decreased levels in basal pain thresholds only in female mice, suggesting the progression to a chronic migraine phase. In the acute protocol, the CBD administration protected both female and male mice from periorbital allodynia induced by a single CGRP injection, and in the chronic one prevented increased levels of basal allodynia induced by repeated CGRP treatment in female mice. Moreover, CBD injected after CGRP, reversed CGRP-evoked allodynia, and also reduced spontaneous pain traits induced by CGRP administration in female mice. Finally, CBD blocked CGRP-induced anxiety in male mice but failed in protecting CGRP-induced photophobia in female mice; 5) female and male NOP(-/-) mice were more sensitive to the effects of both GTN and CGRP compared to wild-type mice, suggesting that the NOP receptor plays a role in migraine onset. In conclusion, this work brings to the scientific community new methodologies, compounds, and evidence useful to speed up the identification and development of new anti-migraine drugs.