Le cellule staminali ematopotiche (HSC) producono cellule del sangue mature su richiesta e si auto-rinnovano la propria popolazione nel midollo osseo che è strettamente regolata attraverso il rimodellamento metabolico ed epigenetico come la metilazione del DNA. DNMT3A è una famiglia di metiltransferasi che catalizza la metilazione de novo del DNA della citosina e viceversa ossidata da TET2 (TET metilcitosina diossigenasi 2) a idrossimetilcitosina e modula la differenziazione delle HSC. È stato dimostrato che le mutazioni in DNMT3A e TET2 promuovono l'auto-rinnovamento dell'HSC in modelli animali e sono considerate mutazioni fondanti nella maggior parte della leucemia mieloide acuta (LMA). In quanto hub di segnalazione epigenetica cruciale nei mitocondri delle HSC, i mitocondri forniscono metaboliti che fungono da cofattori e substrati per enzimi con attività di modificazione epigenetica come la metilazione del DNA. Nonostante abbia attività biochimiche antagoniste, non è chiaro come la perdita di funzione in DNMT3A e TET2 porti a difetti di differenziazione HSC. Pertanto, proponiamo che la disfunzione mitocondriale potrebbe essere al centro dell'inizio della malattia nella pre-leucemia. Pertanto, l'obiettivo di questo studio era valutare la disfunzione mitocondriale nelle mutazioni DNMT3A e TET2 attraverso la profilazione funzionale e molecolare dei fenotipi mitocondriali. Usando il knockdown stabile mediato da shRNA di DNMT3A e TET2 nelle cellule HEK293T, abbiamo dimostrato che la carenza di DNMT3A ha aumentato la biogenesi mitocondriale. In particolare, la perdita di DNMT3A ha migliorato significativamente il volume mitocondriale medio e totale in parallelo con l'aumento del TFAM e del DNA mitocondriale. Inoltre, utilizzando gli indicatori ae-quorin e mito-GCaMP6m, il nostro studio ha mostrato un'interruzione precedentemente non segnalata dell'assorbimento di calcio mitocondriale a causa dell'inattivazione di TET2 e DNMT3A. La nostra indagine meccanicistica rivela che la perdita di shRNA di TET2 ha ridotto il calcio mitocondriale e citosolico a causa di difetti nel rilascio di calcio ER a causa della sottoregolazione di IP3R3. In conclusione, i nostri dati non solo hanno dimostrato la funzione critica di TET2, ma hanno anche identificato nuovi bersagli che potrebbero contribuire all'omeostasi del calcio in Hematopotiec e alla funzione delle cellule staminali leucemiche

Hematopotiec stem cells (HSC) produces mature blood cells on demand and self-renew their own population in the bone marrow which is tightly regulated through metabolic and epigenetic remodeling such as DNA methylation. DNMT3A is family of methyltransferases that catalyzes de novo DNA methylation of cytosine and conversely oxidized by TET2 (TET Methylcytosine Dioxygenase 2) to hydroxymethylcytosine and modulate HSC differentiation. Mutations in DNMT3A and TET2 have been shown to promote self-renewal of HSC in animal models and considered as founding mutations in majority of acute myeloid leukemia (AML). As crucial epigenetic signaling hubs in HSCs mitochondria provide metabolites serving as cofactors and substrates for enzymes with epigenetic modification activity such as DNA methylation. Despite having antagonistic biochemical activities it is unclear how loss of function in DNMT3A and TET2 lead to HSC differentiation defects. Thus, we pro-pose that mitochondrial dysfunction might be at the center of disease initiation in pre-leukemia. Therefore, the goal of this study was to assess mitochondrial dysfunction in DNMT3A and TET2 mutations through functional and molecular profiling of mitochondria phenotypes. Using shRNA mediated stable knockdown of DNMT3A and TET2 in HEK293T cells, we demonstrated that deficiency of DNMT3A increased mitochondrial biogenesis. Specifically, loss of DNMT3A significantly enhanced average and total mitochondrial volume in parallel with increased TFAM and mitochondrial DNA. In addition, by utilizing aequorin and mito-GCaMP6m indicators our study showed previously unreported disruption of mitochondrial calcium uptake due to inactivation of TET2 and DNMT3A. Our mechanistic investigation reveals that shRNA loss of TET2 reduced mitochondrial and cytosolic calcium as a result of defects in ER calcium release due to down regulation of IP3R3. In conclusion, our data not only demonstrated the critical function of TET2 but also identified novel targets that might contribute to calcium homeostasis in Hematopotiec and leukemic stem cell function.

Disruption of DNA methylation and mitochondrial dysfunction in pre-leukemia

KAHSAY, Asrat Endrias
2023

Abstract

Le cellule staminali ematopotiche (HSC) producono cellule del sangue mature su richiesta e si auto-rinnovano la propria popolazione nel midollo osseo che è strettamente regolata attraverso il rimodellamento metabolico ed epigenetico come la metilazione del DNA. DNMT3A è una famiglia di metiltransferasi che catalizza la metilazione de novo del DNA della citosina e viceversa ossidata da TET2 (TET metilcitosina diossigenasi 2) a idrossimetilcitosina e modula la differenziazione delle HSC. È stato dimostrato che le mutazioni in DNMT3A e TET2 promuovono l'auto-rinnovamento dell'HSC in modelli animali e sono considerate mutazioni fondanti nella maggior parte della leucemia mieloide acuta (LMA). In quanto hub di segnalazione epigenetica cruciale nei mitocondri delle HSC, i mitocondri forniscono metaboliti che fungono da cofattori e substrati per enzimi con attività di modificazione epigenetica come la metilazione del DNA. Nonostante abbia attività biochimiche antagoniste, non è chiaro come la perdita di funzione in DNMT3A e TET2 porti a difetti di differenziazione HSC. Pertanto, proponiamo che la disfunzione mitocondriale potrebbe essere al centro dell'inizio della malattia nella pre-leucemia. Pertanto, l'obiettivo di questo studio era valutare la disfunzione mitocondriale nelle mutazioni DNMT3A e TET2 attraverso la profilazione funzionale e molecolare dei fenotipi mitocondriali. Usando il knockdown stabile mediato da shRNA di DNMT3A e TET2 nelle cellule HEK293T, abbiamo dimostrato che la carenza di DNMT3A ha aumentato la biogenesi mitocondriale. In particolare, la perdita di DNMT3A ha migliorato significativamente il volume mitocondriale medio e totale in parallelo con l'aumento del TFAM e del DNA mitocondriale. Inoltre, utilizzando gli indicatori ae-quorin e mito-GCaMP6m, il nostro studio ha mostrato un'interruzione precedentemente non segnalata dell'assorbimento di calcio mitocondriale a causa dell'inattivazione di TET2 e DNMT3A. La nostra indagine meccanicistica rivela che la perdita di shRNA di TET2 ha ridotto il calcio mitocondriale e citosolico a causa di difetti nel rilascio di calcio ER a causa della sottoregolazione di IP3R3. In conclusione, i nostri dati non solo hanno dimostrato la funzione critica di TET2, ma hanno anche identificato nuovi bersagli che potrebbero contribuire all'omeostasi del calcio in Hematopotiec e alla funzione delle cellule staminali leucemiche
BONORA, Massimo
PINTON, Paolo
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Descrizione: Disruption of DNA methylation and mitochondrial dysfunction in pre-leukemia
Tipologia: Tesi di dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11392/2505648
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