EVALUATION OF INOSITOL 1,4,5-TRISPHOSPHATE RECEPTOR, TYPE 3 EXPRESSION AND ACTIVITY PROFILE IN THE CONTEXT OF COLON AND HEAD AND NECK CANCER

I tumori del colon e del distretto cervico-cefalico rappresentano due entità tumorali differenti, sia nell’aspetto istologico, sia nell’entità epidemiologica. Ciononostante, questi tumori originano da parti diverse dell’apparato digerente e, di conseguenza, potrebbero condividere processi tumorigenici comuni. La chemioterapia rimane ancora oggi un pilastro della terapia oncologica. Tuttavia, ad oggi, l’entità dei tumori che mostra chemioresistenza è in continuo aumento e in questo caso i tumori non sono suscettibili allo stimolo apoptotico indotto dal chemioterapico. L’apoptosi è un meccanismo di morte cellulare programmata finemente regolato in cui lo ione calcio (Ca2+) riveste un ruolo importante di modulazione. Infatti, l’incremento protratto nel tempo della concentrazione di Ca2+ a livello mitocondriale è responsabile dell’innesco del processo apoptotico. In questo contesto, l’isoforma 3 dei recettori dell’inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3R3), ovvero un canale permeabile al Ca2+ localizzato a livello delle MAM (mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes), gioca un ruolo centrale, determinando un flusso di Ca2+ “quasi-sinaptico” tra i due organelli. Queste evidenze hanno permesso di identificare IP3R3 come un fattore chiave di regolazione dell’apoptosi e, di conseguenza, di oncogenesi e di chemioresistenza. Il presente studio trae origine dall’idea che la chemioresistenza possa essere dovuta a una riduzione dei livelli di IP3R3 nel tumore. L’obiettivo dello studio è quello di valutare i livelli di espressione di IP3R3 nelle biopsie di adenocarcinoma del colon e del carcinoma squamocellulare cervico-cefalico e nelle mucose sane isogeniche. IP3R3 è stato valutato a livello proteico mediante tecnica western blot e analisi immunoistochimica; inoltre, laddove sia stata identificata la presenza del recettore, è stato eseguito uno studio ex vivo del flusso di Ca2+ mediante microscopia a fluorescenza. I risultati del presente studio indicano che IP3R3 è downregolato in maniera significativa nel tessuto tumorale rispetto alla mucosa sana. Inoltre, il livello di espressione di IP3R3 tra la mucosa sana e il tessuto tumorale risulta sempre più comparabile all’incrementare della classe di rischio tumorale. Secondo questa osservazione, si potrebbe ipotizzare che vi sia una progressiva degenerazione della mucosa sana, con una progressiva riduzione di IP3R3, che di conseguenza comporti una maggiore predisposizione allo sviluppo tumorale. Infatti, la riduzione dei livelli di espressione di IP3R3 nel tessuto tumorale fa supporre che tale recettore rappresenti un oncosoppressore, in quanto degradato o inibito durante la carcinogenesi. Questa ipotesi è inoltre supportata dagli studi di funzionalità, poiché nel tessuto tumorale che esprime IP3R3 il recettore è risultato non funzionale. Pertanto, si potrebbe ipotizzare che il recettore possa essere non funzionale a causa di alterazioni geniche di ITPR3 oppure a seguito di modifiche post-traduzionali da parte delle proteine deputate alla regolazione di IP3R3. In conclusione, i risultati di questo studio suggeriscono che IP3R3 possa svolgere un ruolo di oncosoppressore e che la sua ridotta espressione possa comportare una predisposizione allo sviluppo tumorale, rappresentando potenzialmente un promettente target terapeutico.

Colon adenocarcinoma and head and neck (H&N) squamous cell carcinoma (SCC) are different tumoral diseases, both in histology and epidemiology. Nonetheless, these anatomical sites are parts of the digestive tract and, consequently, could share possible common tumorigenic processes. Chemotherapy remains to date an important treatment for both tumours, especially in advanced stages. Nonetheless, cancer shows different degrees of chemoresistance, meaning the tumour is not susceptible to the apoptotic stimulus induced by the chosen drug. Apoptosis is a fine-tuned mechanism in which calcium (Ca2+) signalling is one of the main actors. In fact, a slow but continuous entry of Ca2+ inside the mitochondria is responsible for the activation of the apoptotic cascade. In this scenario, the family of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs), namely Ca2+ channels that reside at the endoplasmic reticulum membrane, play a pivotal role. In particular, the isoform 3 (IP3R3) is found to be enriched in regions of the endoplasmic reticulum membrane that are close to mitochondria, known as mitochondrial-associated membranes, where it allows the quasi-synaptic Ca2+ transfer from these two organelles. These findings highlight the IP3R3 as a key regulator of apoptosis. Coherently, alterations in IP3R3 expression and/or function were found in many different tumours and proposed to be a key in oncogenesis and chemotherapy resistance. Based on this hypothesis, the present study aimed to assess the IP3R3 expression levels in tumour tissue, assuming that its alteration could be involved in chemoresistance development. Accordingly, the main purpose of this thesis was to evaluate the expression of IP3R3 in colon adenocarcinoma and H&N SCC biopsies and compare it with its expression levels in the isogenic healthy mucosa. IP3R3 was investigated both at the protein level by western blot analysis and immunohistochemistry (IHC). Furthermore, upon IP3R3 detection in the tumour, the receptor functionality was assessed by ex vivo Ca2+ mobility assay. The results of the present study indicate that IP3R3 expression is significantly downregulated in the tumoral context compared to isogenic healthy mucosa, both in the colon and H&N tumours. Interestingly, as the risk class increases, the IP3R3 expression becomes more comparable between the healthy mucosa and the tumoral tissue. According to these data, it is possible to speculate a progressive degeneration of the healthy mucosa, with a progressive reduction of IP3R3 expression leading to a greater tumour predisposition. In fact, the decreased expression of IP3R3 in tumour tissue suggests the role of IP3R3 as a tumour suppressor, which is degraded or inhibited during the carcinogenesis process. This hypothesis is further supported by the functional studies, which indicate that when detected in the tumour tissue IP3R3 is not functional. Thus, it could be assumed that the produced protein could be unfunctional due to ITPR3 alterations or that IP3R3 undergoes post-translational modifications by its regulatory proteins that affect the activity of the Ca2+ channel. In conclusion, these results suggest that IP3R3 is a key tumour suppressor, and its reduced expression may represent a predisposing factor for tumour development, becoming a promising therapeutical target.