Design and synthesis of potential cardioprotective agents targeting mitochondria

Nonostante i recenti progressi nelle strategie interventistiche di riperfusione coronarica, l'infarto miocardico acuto (MI) è una delle forme più frequenti di cardiopatia ischemica e delle principali cause di morte nei Paesi occidentali. Il cosiddetto danno da riperfusione (RI) contribuisce fino al 50% della dimensione finale dell'infarto, limitando l'efficacia dell'intervento coronarico percutaneo. Dati in crescita indicano che l'insorgenza del RI coinvolge vari fattori molecolari e cellulari i quali culminano nella finale apertura di un poro nella membrana mitocondriale, il poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP). mPTP è noto come uno dei principali processi responsabili del RI e della morte dei cardiomiociti, nonché un bersaglio terapeutico per la cardioprotezione. mPTP è definito come una piattaforma multiproteica costituita da elementi strutturali e modulatori che contribuiscono al suo stato conformazionale aperto/chiuso. Sono stati identificati diversi inibitori di mPTP, tra cui Ciclosporina A (CsA) e TRO-40303 che hanno raggiunto gli studi clinici, con risultati incoerenti per quanto riguarda la loro azione cardioprotettiva. L’incompleta conoscenza della struttura di mPTP è il principale ostacolo nella scoperta di nuovi farmaci. Dati recenti mostrano il reclutamento della ATP sintasi nella formazione di mPTP. Secondo tale modello, specifici cambiamenti possono convertire l’enzima ATP sintasi che fornisce energia in un'entità supramolecolare che dissipa energia, mPTP. Varie ricerche hanno provato che la subunità c della F1FO-ATP sintasi svolge un ruolo centrale nella formazione di mPTP. I principali “triggers” dell'apertura di mPTP sono l'aumento della concentrazione di calcio intra-mitocondriale e delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). Inoltre, i ROS possono di per sé portare a danni agli organi, disfunzioni, ipertrofia e infiammazione. Considerando il bisogno insoddisfatto di terapie del RI e di nuove strategie cardioprotettive, la tesi di dottorato si è focalizzata sui seguenti obiettivi: 1) Scoperta di nuovi inibitori di mPTP mirati alla subunità c dell'ATP sintasi come agenti cardioprotettivi: l'attività svolta ha portato all'identificazione di tre serie di spiro-composti. In primo luogo, è stato esaminato il nucleo isatinico, uno scaffold che ha suscitato interesse nella chimica farmaceutica. Sono stati poi esplorati modelli più complessi, con la prospettiva di ampliare la gamma di chemotipi in questo settore di ricerca. Infine, è stata applicata una strategia di sintesi in fase solida per ottenere una libreria di derivati spiro-piperidinici. La potenza di tutti i composti è stata valutata in vitro mediante il saggio cobalto-calceina. 2) Progettazione e sintesi di “tools” per l'identificazione del sito di legame delle nostre molecole alla proteina bersaglio e l'individuazione di eventuali off-targets: al fine di orientare la ricerca verso un approccio più razionale di progettazione di farmaci, sono state sviluppate due serie di sonde di foto-affinità (PAPs), contenenti un'unità fotoreattiva e un gruppo alchino. Tra le PAPs studiate, sono stati identificati due promettenti candidati, potenzialmente utili per progredire in questo settore di ricerca. 3) Progettazione di nuovi agenti cardioprotettivi mirati ai mitocondri, come potenziali “scavenge” di ioni di metalli di transizione redox-attivi: poiché i ROS sono implicati nell'IRI e gli ioni ferro, nell'ambiente mitocondriale, sono noti per esercitare un'azione pro-ossidante, sono stati progettati, sintetizzati e caratterizzati derivati costituiti da un chelante del ferro (DFO) legato a un “drug delivery” mirato ai mitocondri (peptide SS31). Le due classi di composti risultanti dalla tesi finale di dottorato, inibitori spiro-ciclici di mPTP e agenti antiossidanti, potrebbero esercitare un'azione cardioprotettiva sinergica, in caso di co-somministrazione, che sarà indagata in studi futuri.

Despite recent advances and success in interventional coronary reperfusion strategies, acute myocardial infarction (MI) is recognized as one of the most frequent forms of ischemic heart disease and one of the leading causes of death in Western countries. The so-called reperfusion injury (RI) contributes for up to the 50% of the final infarct size, thus restricting the efficacy of primary percutaneous coronary intervention. Rising data indicate that the onset of RI involves several molecular and cellular factors that culminate in the final opening of a large pore in the mitochondrial membrane, namely the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). mPTP is recognized as one of the main biochemical processes responsible for RI and for cardiomyocyte death, as well as a major therapeutic target for cardioprotection. mPTP is defined as a multiprotein platform including pore-forming elements and modulators that contribute to its open/closed conformational state. Several mPTP inhibitors have been identified, among which Cyclosporin A (CsA) and TRO-40303 have reached clinical studies. However, inconsistent results have been achieved as far as their cardioprotective action. The incomplete knowledge of the bio architecture of mPTP is the main obstacle in drug discovery programs. Recent data point to a role for ATP synthase in mPTP formation. According to this model, peculiar changes can convert the energy-supplying ATP synthase machine into an energy-dissipating supramolecular entity, mPTP. Independent studies provided that the c-subunit of F1FO-ATP synthase plays a pivotal role in mPTP formation. The main triggers of mPTP opening are the increase of intra-mitochondrial calcium concentration and of reactive oxygen species (ROS) by-products. Additionally, ROS may lead per-se to target-organ damage, dysfunction, hypertrophy and inflammation. Considering the unmet need with respect to RI therapy and novel cardioprotective strategies, this doctoral thesis has focused on the following objectives: 1) Discovery of mPTP inhibitors targeting the c-subunit of ATP synthase as cardioprotective agents: the medchem activity resulted in the identification of three new series of spiro compounds. Firstly, it has been examined the isatin ring, a scaffold that has attracted strong interest in medicinal chemistry. More complex spiro templates have been then explored, with the perspective of expanding the range of chemotypes in this research area. Finally, a solid-phase strategy has been applied in order to synthesize a library of spiro-piperidine derivatives. The potency of all the synthesized compounds was assessed through the in vitro cobalt-calcein assay. 2) Design and synthesis of molecular tools to be employed for the identification of the binding site of our molecules at the target protein and the detection of possible off-targets: in order to guide the research towards a more rational structure-based drug design approach, two series of photo-affinity labeling probes (PAPs), containing a photoreactive unit and an alkyne handle, have been developed. Among the investigated PAPs, two suitable tools have been discovered, which may be extremely useful to progress in this medchem area. 3) Design of novel mitochondria-targeted cardioprotective agents potentially able to scavenge redox-active transition metal ions: since ROS are strongly implicated in IRI and iron ions in the mitochondrial environment are known to exert a prooxidant action, derivatives composed of an iron chelator (DFO) linked to a mitochondria-targeted drug delivery system (peptide SS31) have been designed, synthesized and characterized. The two classes of compounds resulting from the final doctoral thesis, spirocyclic mPTP inhibitors and antioxidant agents, could exert a synergistic cardioprotective action upon co-administration that will be investigated in future studies.