Pathophysiology of the P2X7 receptor in the skeleton

Gli effetti biologici dell’ATP sono mediati dai recettori purinergici e, fra loro, P2X7R presenta caratteristiche molecolari e funzionali uniche. P2X7R è coinvolto in una serie di attività fisiologiche dell’apparato scheletrico, comprese solo in parte, oltre ad essere stato associato ad alcune malattie delle ossa e delle articolazioni, e, per queste ragioni, proposto come potenziale bersaglio terapeutico. Il lavoro di questa tesi si inserisce in un progetto più ampio finalizzato ad identificare nuovi target molecolari per lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative nel trattamento di patologie che colpiscono ossa e cartilagini, e nel rallentamento del processo di degenerazione fisiologica dovuto all'invecchiamento. In linea con questo obiettivo, l’attenzione è stata anche rivolta alla messa a punto di modelli sperimentali in vitro aderenti al microambiente scheletrico in vivo, al fine di ottenere risultati particolarmente informativi. Lo studio si è rivolto prevalentemente a studiare: - la partecipazione di P2X7R nella maturazione delle cellule deputate alla deposizione di matrice mineralizzata cellulare. Cellule staminali da gelatina di Wharton del cordone ombelicale (hWJ-MSCs) e osteoblasti ottenuti da frammenti di tessuto osseo (hOBs) sono stati coltivati in condizioni di ipossia e normossia, trattati con antagonisti di P2X7R e apirasi (scavenger di ATP e ADP). I risultati ottenuti ci hanno permesso di attribuire un ruolo a P2X7R non tanto nel processo differenziativo a carico delle cellule staminali quanto nella capacità degli hOBs di depositare matrice mineralizzata. Inoltre, nell’indagare il possibile ruolo di fattori di trascrizione osteogenici nella modulazione dell'espressione di P2X7R, i dati di immunoprecipitazione della cromatina e trasfezione con vettori di espressione specifici hanno dimostrato: a. la presenza nel promotore del gene di P2RX7 di diversi siti di legame per fattori di trascrizione osteogenici; b. il reclutamento del fattore NFATc1 in siti specifici del promotore di P2X7R; c. l’aumento dell’espressione di P2X7R in seguito all’over espressione di NFATc1. - la partecipazione di P2X7R nell’omeostasi del disco intervertebrale (IVD). I meccanismi che sostengono l’insorgenza e la progressione dell’alterazione del microambiente dell’IVD sono ancora poco compresi. E’noto che l’ATP extracellulare è in grado di attivare l’inflammosoma NLRP3 con la partecipazione di P2X7R e il rilascio di IL-lβ. Questa citochina si ritiene sia l’evento chiave che contribuisce alla degenerazione del disco. Nello studio di questa tesi 83 campioni di IVD con diverso grado di degenerazione (Pfirrmann I-V) sono stati raccolti dopo l’intervento chirurgico, e impiegati sia per l’analisi istologica che per la realizzazione di colture primarie di cellule discali. I dati finora ottenuti hanno dimostrato che: a. il livello di degenerazione tissutale o sdifferenziamento cellulare correla con l’aumentata espressione di P2X7R e NLRP3; b. il rilascio di IL-1β è condizionata dalla presenza di LPS e BzATP (agonista del P2X7R), indicando un coinvolgimento dell’asse P2X7R-NLRP3. In conclusione è dimostrato che il P2X7R ed il suo target (NLRP3) sono coinvolti nella patogenesi della degenerazione del disco intervertebrale. Nell’insieme, i dati ottenuti suggeriscono che P2X7R rappresenti un buon bersaglio molecolare sia per promuovere l’attività anabolica delle cellule dell’osso deputate a depositare matrice ossea, sia per rallentare i processi infiammatori responsabili della degenerazione del disco intervertebrale.

The biological effects of ATP are mediated by purinergic receptors, and, among them, P2X7R exhibits unique molecular and functional features. P2X7R is involved in a series of skeletal physiological activities, and it has also been associated in some bone and joint diseases. Thereby, P2X7R can be considered a potential drug target. The work of this thesis is part of a broader project aimed at identifying new molecular targets for the development of innovative therapeutic strategies to be used for the treatment of pathologies that affect bone and cartilage, and for slowing the physiological degeneration process due to aging. Aligned with this goal, the attention was also to optimize in vitro experimental models for mimicking the in vivo skeletal microenvironment, in order to obtain informative results. The main goals of the study were: - the participation of P2X7R in the maturation of cells responsible for the deposition of cellular mineralized matrix. Wharton’s jelly mesenchymal stromal cells from umbilical cord (WJ-MSCs) and osteoblasts from bone fragments (hOBs) were cultured in hypoxia and normoxia conditions, and treated with P2X7R antagonists and apyrase (scavenger of ATP and ADP). The results obtained allowed us to attribute a role to P2X7R not so much in the differentiation process of stromal cells, but in the ability of hOBs to deposit mineralized matrix. Furthermore, in investigating the possible role of osteogenic transcription factors in the modulation of P2X7R expression, the data of chromatin immunoprecipitation and transfection with specific expression vectors have shown: a. the presence in the P2RX7 gene promoter of different binding sites for osteogenic transcription factors; b. the recruitment of NFATc1 factor in specific sites of the P2RX7 promoter; c. the increase in the expression of P2X7R following the over expression of NFATc1. - the participation of P2X7R in intervertebral disc homeostasis (IVD). The mechanisms that support the onset and progression of the alteration of the IVD microenvironment are still poorly understood. It is known that the extracellular ATP is able to activate the NLRP3 inflammasome with the participation of P2X7R and the release of IL-1β. This cytokine is believed to be the key event contributing to disc degeneration. In the study of this thesis 83 IVD samples with different degrees of degeneration (Pfirrmann I-V) were collected after surgery, and used for histological analysis and for primary disc cell cultures. The data obtained so far have shown that: a. the level of tissue degeneration or cellular de-differentiation correlates with the increased expression of P2X7R and NLRP3; b. the release of IL-1β is conditioned by the presence of LPS and BzATP (P2X7R agonist), indicating an involvement of the P2X7R-NLRP3 axis. In conclusion, we demonstrated that P2X7R and its downstream target (NLRP3 inflammasome) are involved in pathogenesis of IVD degeneration. Overall, the data obtained suggest that P2X7R represents a good molecular target to promote the anabolic activity of the bone cells responsible for depositing bone matrix, and to slow down the inflammatory processes responsible for the degeneration of the intervertebral disc.