Applications of innovative technologies for the cellular and molecular analysis of a non-model organism, the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus), in a changing and challenging marine environment

Il tursiope, Tursiops truncatus, è un mammifero completamente adattato alla vita in mare. E’ un animale longevo, predatore di apice, ha un’attitudine costiera e residente, e inoltre presenta uno deposito di grasso sottocutaneo, in cui si accumulano facilmente tossine di origine antropica. Queste caratteristiche lo rendono un ideale indicatore dello stato di salute dell’ecosistema marino. La sua condivisione con l’uomo degli ambienti costieri marini, e del nutrimento che ne deriva, ne fanno anche un ottimo organismo sentinella per problemi di salute pubblica. In questa tesi è presentata l'applicazione delle più innovative tecnologie nel campo della biologia cellulare e molecolare allo studio della biologia e dello stato di salute del tursiope. Tra le nuove tecnologie presentate ci sono sia gli ultimi approcci di trascrittomica, come microarray e RNA-sequencing, sia le ultime novità nel campo delle colture cellulari, come l’utilizzo di cellule staminali. Il primo studio descritto presenta l’accoppiamento di un saggio ex vivo ad analisi di espressione genica, utilizzando un microarray specie-specifico. Fettine di tessuto cutaneo di tursiope sono state messe in cultura e trattate con diverse concentrazioni di bisfenolo A e di acido perfluoroottanoico, per analizzare variazioni dell’espressione genica indotta da questi due contaminanti, appartenenti della categoria dei contaminanti emergenti. Il trascrittoma della pelle ha dimostrato di essere informativo di esposizioni a contaminanti e potenzialmente predittivo dello stato di salute del tursiope. Inoltre, i geni differenzialmente espressi identificati tramite questa analisi hanno mostrato essere una buona fonte da cui selezionare biomarcatori per la valutazione dell’esposizione a contaminanti antropici. Sebbene la tecnologia dei microarray continui ad avanzare, generando trascrittomi a sempre più alta risoluzione, essa può essere impiegata solo per analizzare sequenze già note, tralasciando nuove informazioni su RNA e loro varianti. Negli ultimi anni la trascrittomica ha subito un notevole incremento, principalmente grazie all’impiego di next generation sequencing in RNA-seq. Il secondo studio affrontato in questa dissertazione ha utilizzato RNA-seq per un’analisi longitudinale attraverso le stagioni, di un gruppo di delfini monitorati mensilmente in ottime condizioni di salute, al fine di generare dati di riferimento per analisi trascrittomiche di sangue del tursiope. I geni espressi nelle quattro stagioni sono, per la maggior parte, gli stessi evidenziati da studi analoghi sull’uomo, se pur in numero notevolmente inferiore. Oltre alla variabilità introdotta dalla stagionalità, sono stati evidenziati moduli di co-espressione genica associati con età, genere e valori ematologici degli animali. L’ultima sperimentazione presentata descrive la messa a punto di un protocollo sviluppato per isolare e caratterizzare cellule staminali mesenchimali con un duplice scopo di creare una banca cellulare per uso terapeutico per il tursiope stesso, e di avere una fonte illimitata di cellule per ricerca ed applicazioni biomediche. Il protocollo prevede l’utilizzo del tessuto placentale e del cordone ombelicale e offre un’alternativa meno invasiva al metodo attuale di isolamento delle cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo. Le cellule staminali mesenchimali isolate si mantengono stabili nelle condizioni di coltura testate, con cariotipo specie-specifico, e rispondono positivamente ad ogni test di verifica di identità e comportamento. L’applicazione di tecnologie di avanguardia allo studio di un organismo non-modello, come nel caso del tursiope evidenziato in questa tesi, ha mostrato un sostanziale e approfondito contributo alla comprensione della biologia e dello stato di salute del tursiope, stabilendo la sua rilevanza in studi futuri incentrati sugli effetti dei cambiamenti ambientali sugli abitanti dell’ecosistema marino costiero.

The bottlenose dolphin, Tursiops truncatus, is a mammal completely adapted to marine life. As long-lived, long-term residents of bays, sounds, and estuaries, high trophic feeder with large blubber stores, acting as depots for anthropogenic toxins, dolphins can be used as important indicators of the health of the marine ecosystems. Dolphins consume the same food and share the coastal environment with humans thus serving also as effective sentinels for public health problems. In this dissertation, the latest new technologies in cell and molecular biology are applied to the study of bottlenose dolphin biology and health. Included in the new technologies presented are the most used (microarray) and the most current (RNA sequencing, RNAseq) transcriptomic approaches, and novel technologies in stem cell research for subsequent in vitro testing. In the first investigation, an ex vivo assay was applied to gene expression microarrays. Small slices of bioptic skin from the bottlenose dolphin were cultured and exposed to different concentrations of perfluorooctanoic acid (PFOA) and bisphenol A (BPA), to assess the variation in global gene expression induced by two contaminants of emerging concerns (CECs). Transcriptomic changes were analyzed using a species-specific microarray. The skin transcriptome hold information on contaminant exposure, potentially predictive of longterm effects on dolphin health. Moreover, the differentially expressed genes have shown to be a good resource for identification of contaminant-specific biomarkers of exposure. Although microarrays technology continues to advance generating high throughput transcriptomics, it can only be employed to detect known sequences, and can’t be used to discover novel RNA forms and variants. The transcriptomics dramatic expansion observed in the past few years is mainly due to the developments in RNA-seq. In the second investigation presented, we performed longitudinal analysis of healthy managed bottlenose dolphins across seasons to establish baseline data for blood transcriptome analysis using RNA-seq. Dolphin genes showed less seasonal variability than that reported in humans, but the majority of significant genes identified were shared. Besides the seasonal component to changes in blood gene expression, associations of gene co-expression modules with age, gender or hematological parameters were also found. The last study presents the development of a protocol to isolate and characterize stem cells for the creation of a cell bank for dolphin’s therapeutic use and of an unlimited source of cells for research and biomedical applications. The protocol is developed to be a lessinvasive alternative of current mesenchymal stem cells isolation methods (such as the isolation of stem cells from adipose tissue) and it is focused on the placental tissue and the umbilical cord. Quantitative metrics were used to confirm the morphology of the cells, and gene and protein markers of stemness were also examined. The mesenchymal stem cells characterized were viable, with a proper karyotype, and responded positively to the verification tests employed. The application of the latest technologies to non-model organisms research, such as in the dissertation here presented, reveled a significant contribution for a deeper understanding of the biology and health of the dolphin, establishing its relevance for future studies of the impact of environmental challenges on the marine inhabitants.