The P2X7 receptor modulates extracellular ATP levels cell to cell communication and chemoresistance in oncogenesis

Nel microambiente tumorale l’ATP tramite il recettore P2X7 attiva la risposta immunitaria, la proliferazione e la metastatizzazione. Nel mio progetto di dottorato ho analizzato il ruolo dell'ATP extracellulare (eATP) e del recettore P2X7 nella leucemia mieloide acuta (LMA) e nel melanoma. Abbiamo dimostrato che il chemioterapico daunorubicina causa il rilascio di ATP nel microambiente tumorale inducendo l'attivazione di una risposta immunitaria antitumorale. Abbiamo inoltre analizzato l'espressione delle due principali varianti di splicing del recettore (P2X7A e P2X7B) in una popolazione costituita da pazienti affetti da sindrome mielodisplastica e pazienti affetti da MLA non ancora sottoposti a chemioterapia. L’espressione di entrambe le isoforme aumenta nei pazienti con leucemia suggerendo che entrambe le isoforme correlino con la progressione della patologia. Invece, tra i pazienti LMA sottoposti a chemioterapia, quelli in remissione presentano una diminuzione dell’espressione di entrambe le isoforme mentre quelli in ricaduta presentano una diminuzione dell'isoforma A e un aumento dell'isoforma B. I dati ottenuti suggeriscono che i blasti leucemici esprimenti prevalentemente l'isoforma B siano in grado di resistere agli effetti citotossici della chemioterapia. Un modello murino di leucemia ci ha permesso di verificare l’effetto di un farmaco antagonista del recettore P2X7 (AZ10606120) sulla crescita tumorale e sull'espressione delle isoforme A e B. Entrambi i farmaci riducono la crescita tumorale, ma se somministrati contemporaneamente sono più efficaci. Interessante è notare che la daunorubicina da sola causi un aumento dell'espressione del P2X7B nel tumore, mentre la somministrazione insieme all'antagonista ne riduca l'espressione. Abbiamo inoltre dimostrato che la presenza del P2X7A nelle cellule aumenta la tossicità della daunorubicina mentre il P2X7B ha un effetto protettivo nei suoi confronti. In conclusione nella LMA P2X7A e P2X7B possono essere considerati dei marcatori diagnostici data la loro diversa espressione e funzione in risposta alla chemioterapia e nei casi in cui ci sia una prevalenza del P2X7B questo potrebbe essere utilizzato come bersaglio terapeutico. Abbiamo inoltre dimostrato che l'antagonista P2X7 è efficace nel ridurre la crescita tumorale anche in un modello in vivo di melanoma primario. Abbiamo studiato l'espressione del recettore nei melanomi metastatici e il suo ruolo nella formazione di metastasi. L'analisi di pazienti con melanoma ha dimostrato come l'espressione del recettore aumenti con l’aumentare della distanza dei siti di insorgenza delle metastasi rispetto al tumore primario. Esperimenti condotti in vitro hanno evidenziato come il trattamento con antagonisti del P2X7 riduca la proliferazione cellulare, la capacità di formare colonie su soft agar e la migrazione di cellule di melanoma. Invece, con un esperimento in vivo abbiamo dimostrato come il trattamento dei topi con un antagonista del P2X7 riduca la diffusione delle cellule di melanoma e la formazione di metastasi. I meccanismi molecolari attivati dal recettore durante il processo di metastatizzazione non sono del tutto chiari. Perciò abbiamo deciso di studiare il rilascio di vescicole in seguito alla stimolazione del recettore. Abbiamo dimostrato come l’attivazione del P2X7 causi il rilascio di vescicole di diverse dimensioni dalle cellule di melanoma. L’analisi dei microRNA contenuti nelle vescicole raccolte prima e dopo stimolazione del recettore ha mostrato come queste vescicole trasportino miRNA a concentrazioni differenti o di natura diversa. Questi risultati suggeriscono che il recettore P2X7 giochi un ruolo importante nella metastatizzazione del melanoma probabilmente attraverso il rilascio di vescicole e perciò può essere considerato un potenziale bersaglio farmacologico per le forme avanzate di melanoma.

ATP accumulates in the tumour microenvironment (TME) and via its receptor P2X7 is involved in immune response, cancer proliferation and metastasis formation. In this study we investigated ATP release, P2X7 expression and its function in acute myeloid leukemia (AML) and melanoma. In an in vivo AML model, treatment with daunorubicin causes the release of ATP in TME that is associated to tumour eradicating immune response. When we analysed the two functional P2X7 isoforms (P2X7A and P2X7B) in an AML population we observed that they are both overexpressed in patients affected by AML as compared to myelodysplastic syndrome, a pre-cancerous condition leading to AML development, supporting the hypothesis that both receptors variants positively correlate with disease progression. Interestingly, when we subdivided AML patients according to diagnostic phase, we observed that in relapsing patients while P2X7A decreases, P2X7B is significantly increased. On the contrary, when comparing de novo with remitting patients both P2X7A and B show a tendency to decrease. These data suggest that P2X7B over-expressing blasts could be resistant to chemotherapy and responsible for the relapse of AML, due to the differential activity as cytolytic pore (P2X7A) and proliferation promoting channel (P2X7B) of the two isoforms. Moreover, only P2X7A acts as facilitating pathway for cellular uptake of daunorubicin. Accordingly, in an AML murine models both daunorubicin and the P2X7 antagonist AZ10606120 significantly reduced tumour cell growth but the co-administration of the two drugs proved more efficacious. Of interest, while daunorubicin alone caused an increase in P2X7B expression in the tumour, the co-treatment with the P2X7 blocking drug was able to reduce P2X7B levels. Aiming to explain these results, we demonstrated that daunorubicin toxicity was strongly increased in cells expressing only P2X7A, while expression of P2X7B protected the cells from daunorubicin-dependent death. Taken together our data suggest that both P2X7A and P2X7B isoforms could be useful prognostic markers and P2X7B could be a potential therapeutic target in AML. Similarly to what demonstrated for AML, P2X7 antagonism significantly decreased primary tumour growth in an in vivo model of melanoma. However, metastatic forms of melanoma are those representing clinical challenge and in need of new therapies, therefore we extended our P2X7 study to metastatic form of the disease. Analysis of melanoma patients showed an increased P2X7 expression in melanoma with metastasis at distant sites as compared to low disseminating form suggesting an association between over-expression of the receptor and metastatic spreading. To study whether P2X7 antagonism can also inhibit melanoma invasiveness we performed in vitro experiments showing that P2X7 blocking drugs significantly reduced proliferation, transformation and colony formation of melanoma cells. While in an in vivo experiment P2X7 antagonist slowed down the spreading of melanoma cells reducing metastasis formation. In an effort to identify the mechanisms activated by P2X7 in metastatic melanoma, we studied release of vesicles, a mechanism involved in cell-to-cell communication, tumour growth promotion and metastatic evolution. We demonstrated P2X7 dependent release from melanoma cells of large and small vesicles, and the analysis of the miRNA content, before and after P2X7 stimulation, showed a different global miRNA expression profile. These data suggest a possible role of P2X7 in melanoma dissemination maybe due to vesicles release and make P2X7 a potential pharmacological target for advanced melanoma treatment.