eNOS and ANGPT2 polymorphisms in advanced hepatocellular carcinoma patients receiving Sorafenib

Introduction: Sorafenib, an oral multi-kinase inhibitor, represents the standard of care for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), even if a large number of patients reports limited efficacy with respect to toxic effects. Biomarkers of sorafenib efficacy or resistance have yet to be identified. Angiogenesis is one of the most involved pathways in the mechanism of action of sorafenib. Sorafenib may reduce endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity by inhibiting vascular endothelial growth factor receptors (VEGFRs) , leading to a decrease in nitric oxide production. Moreover, angiopoietin-2 (Ang-2) is an angiogenic factor that binds Tie2 receptor and cooperates with the VEGF pathway to maintain physiological functions. Genetic variants in eNOS and Ang-2 gene (ANGPT2) may lead to altered activities of the gene. Llovet and co-workers have found that baseline plasma Ang2 concentrations predicted survival in patients with advanced HCC. The aim of the present study, performed at the Biosciences Laboratory of the Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS in Meldola (FC), was to evaluate the prognostic value of different single nucleotide polymorphisms (SNPs) on eNOS and ANGPT2 genes in patients with advanced HCC receiving sorafenib treatment. Methods: Our retrospective multicenter Italian study included 135 advanced HCC patients all undergoing sorafenib treatment from 2012 to 2015. Genotyping analysis was performed on DNA extracted from blood samples. Two eNOS polymorphisms (eNOS -786T>C and eNOS+894G>T) were analyzed by Real Time PCR, while eNOS VNTR 27bp 4a/b and eight ANGPT2 polymorphisms (rs3739390, rs3739391, rs3739391, rs1961222, rs3020221, rs6559167, rs2916747, rs17063434) were analyzed by direct sequencing, in relation to overall survival (OS) and progression-free survival (PFS). Results: All genotype frequencies followed the Hardy-Weinberg equilibrium. In univariate analysis, eNOS-786 and ANGPT2 rs55633437 were associated with overall survival (OS) and progression free survival (PFS). In particular patients with eNOS-786 TC or CC genotypes had a significantly higher median OS (15.6 vs. 9.1 months, hazard ratio [HR] 0.65 95% CI 0.44-0.97; P=0.036) and PFS (7.03 vs. 3.5 months, HR 0.43 95% CI 0.30-0.63; P < 0.001) than patients homozygous for T allele. Moreover patients with ANGPT2 rs55633437 TT or GT genotypes had a significantly lower median OS (4.66 vs 15.5 months, HR 4.86, 95% CI 2.73-8.67, P < 0.001) and PFS (1.58 vs 6.27 months, HR 4.79, 95% CI 2.73-8.35, P < 0.001) than those homozygous for G allele. Multivariate analysis confirmed these polymorphism as the independent prognostic factors. Conclusion: Our results suggest that eNOS-786 and ANGPT2 rs55633437 polymorphisms may be capable of identifying a subset of HCC patients who are more responsive or resistance to sorafenib in terms of OS and PFS. These data will be confirmed in our ongoing multicenter prospective study (NCT02786342).

Introduzione: L’epatocarcinoma (HCC) è il tumore primitivo più frequente del fegato. Il sorafenib, un inibitore multi tirosin-chinasico orale, rappresenta lo standard di cura per l’epatocarcinoma (HCC) avanzato, tuttavia una larga porzione di pazienti non sembra beneficiare del trattamento e risulta quindi essere esposta a tossicità non necessarie. Ad oggi però mancano dei biomarcatori che premettano una selezione più accurata dei pazienti da trattare. La via dell’angiogenesi è una delle pathway più coinvolte nel meccanismo d’azione del sorafenib. Il sorafenib può ridurre l'attività dell'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) inibendo i recettori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFRs), portando a una diminuzione della produzione di ossido nitrico. Inoltre, l'angiopoietina-2 (Ang-2) è un fattore angiogenico che lega il recettore Tie2 e coopera con il pathway del VEGF. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) nei geni eNOS e dell’Ang-2 (ANGPT2) possono alterare l’espressione e l’attività dei geni stessi. Nello studio di fase III di Llovet et al.(2012), elevati livelli plasmatici basali di Ang-2 risultavano associati a caratteristiche patologiche più avanzate e ad una peggior sopravvivenza globale in pazienti con HCC avanzato. Lo scopo dello studio, svolto presso il Laboratorio di Bioscienze dell'Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) dell'IRCCS di Meldola (FC), è stato quello di valutare il valore prognostico di diversi SNPs sui geni eNOS e ANGPT2 in pazienti con HCC avanzato trattati con sorafenib. Metodi: E’ uno studio retrospettivo multicentrico italiano che ha incluso 135 pazienti con HCC avanzati sottoposti a trattamento con sorafenib dal 2012 al 2015. L'analisi di genotipizzazione è stata eseguita su DNA estratto da campioni di sangue periferico. Due polimorfismi di eNOS (eNOS -786T> C ed eNOS + 894G> T) sono stati analizzati mediante Real Time PCR, mentre eNOS VNTR 27bp 4a/b e 8 polimorfismi di ANGPT2 (rs3739390, rs3739391, rs3739391, rs1961222, rs3020221, rs6559167, rs2916747, rs17063434 ) sono stati analizzati mediante sequenziamento diretto. I diversi polimorfismi sono stati analizzati in relazione alla sopravvivenza globale (OS) e alla sopravvivenza libera da progressione (PFS). Risultati: Tutte le frequenze genotipiche seguono l'equilibrio di Hardy-Weinberg. Nell'analisi univariata, eNOS-786 e ANGPT2 rs55633437 sono risultati associati all’OS e alla PFS. In particolare i pazienti con genotipo eNOS-786 TC o CC presentavano una OS mediana significativamente più lunga (15,6 vs 9,1 mesi, hazard ratio [HR] 0,65 95% CI 0,44-0,97; P = 0,036) e una PFS mediana significativamente più lunga (7,03 vs 3,5 mesi, HR 0,43 IC 95% 0,30-0,63; P <0,001) rispetto ai pazienti omozigoti per l'allele T. Inoltre i pazienti con genotipo ANGPT2 rs55633437 TT o GT risultavano significativamente associati con una OS peggiore (4,66 vs 15,5 mesi, HR 4,86, 95% CI 2,73-8,67, P <0,001) e una PFS peggiore (1,58 vs 6,27 mesi, HR 4,79, IC 95% 2,73 -8,35, P <0,001) rispetto ai pazienti portatori del genotipo GG. L'analisi multivariata ha confermato questi polimorfismi come fattori prognostici indipendenti. Conclusioni: I nostri risultati suggeriscono che i polimorfismi di eNOS-786 e ANGPT2 rs55633437 possono essere in grado di identificare un sottogruppo di pazienti HCC che sono più o meno responsivi alla terapia con sorafenib in termini di OS e PFS. Questi dati saranno confermati nel nostro studio multicentrico prospettico in corso (NCT02786342).