Introduzione: la distrofina muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria grave. Essa è causata da mutazioni del gene DMD che portano all’assenza della proteina distrofina. Diverse terapie sono state sviluppate finora e alcune si sono rivelate efficaci nel migliorare il decorso clinico, in particolare grazie all’ uso di corticosteroidi che hanno prolungato la fase di deambulazione e migliorato la funzione respiratoria. Vari studi clinici (fase I-IV) sono in corso, spesso basati su approcci di medicina personalizzata, ma i risultati non sono ancora disponibili. Tra questi, Eteplirsen (Exon51Dys) e Translarna (Ataluren) hanno avuto l’approvazione come farmaci orfani. Il ritmo circadiano coordina i processi biologici con il caratteristico ciclo di 24h; il suo ruolo nel regolare le funzioni muscolari è noto sia negli animali che nell’uomo. Metodi: allo scopo di studiare il ruolo dei geni del ritmo circadiano nella DMD, abbiamo disegnato ad hoc una micro fluidic card basata su sistemi TaqMan (Fluid-CIRC), che comprende 30 geni del ritmo circadiano e della rigenerazione muscolare. Tali geni sono stati selezionati anche in base a precedenti dati che hanno mostrato che i geni circadiani (Clock) sono deregolati in altre malattie muscolari. Abbiamo analizzato i muscoli gastrocnemio e tibiale anteriore di topi mdx, esercitati e non, e dei primi, sia muscoli non trattati che trattati con composti in corso di valutazione per i loro effetti sulla malattia. Abbiamo poi selezionato i 7 geni più alterati ed analizzata l’espressione con sistemi TaqMan in 10 DMD. Abbiamo inoltre disegnato tre sistemi ELISA per dosare i geni maggiormente up-regolati (CSNK1ɛ, SIRT1, MYOG) nel plasma di DMD. Risultati: i geni circadiani hanno mostrato una profonda de-regolazione negli mdx, sia esercitati che non. Nei non esercitati più del 90% dei geni era down-regolato, sia nel GC che nel TA, fatta eccezione per MyoG, Tim e Tgfb1. MyoG, un fattore di trascrizione muscolare, coinvolto nel differenziamento, era il maggiormente up-regolato. Tim è uno dei geni circadiani e la sua up-regolazione era più evidente nel TA. Tgfb1 è un fattore chiave del processo di fibrosi, e una sua up-regolazione era più evidente nel GC. Il confronto tra non esercitati ed esercitati seguiva un comportamento opposto nei due muscoli. Mentre nel GC circa il 100% dei geni era up-regolato, nel TA tutti i geni erano down-regolati. Questo peculiare comportamento può trovare ragione nella diversa funzione dei due muscoli. Tra i geni analizzati abbiamo poi selezionato i 7 maggiormente de-regolati ed analizzata l’espressione nei topi trattati. Una tendenza verso la normalizzazione era evidente per tutti i trascritti e tutti i composti. I 7 geni selezionati sono stati analizzati in biopsie di 10 pazienti DMD. I geni maggiormente up-regolati erano CSNK1ɛ, SIRT1 e MYOG. Allo scopo di esplorare se tale de-regolazione potesse riflettersi anche a livello proteico, abbiamo disegnato un sistema ELISA per la proteina CSNK1ɛ ed analizzato il plasma di 14 DMD, 2 BMD e 5 controlli. CSNK1ɛ ha mostrato livelli plasmatici variabili ma la coorte di studio è limitata ed un’espansione del numero di pazienti è necessaria. Conclusioni: i dati dimostrano per la prima volta che l’espressione dei geni circadiani è alterata nel topo mdx. Arntl, cry1, cry2, sirt1, csnk1ɛ, myod e myog sono stati prioritizzati e confermati per essere affetti anche in pazienti DMD; MYOG, SIRT1 e CSNK1ɛ sono stati identificati come i maggiormente up-regolati. Ciò suggerisce un possibile ruolo come biomarcatori di severità clinica tuttavia un allargamento della coorte di studio, includendo BMD, è necessaria. Inoltre, il trend verso la normalizzazione di tutti i trascritti osservata nei topi mdx trattati apre interessanti prospettive per la validazione di tali geni come biomarcatori di efficacia per le nuove terapie in via di sviluppo.
Introduction: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe hereditary muscle wasting disease. It is caused by mutations in the DMD gene, that lead to a complete absence of the protein dystrophin. Different treatments have been developed so far and some of them were successful in ameliorating the disease course, especially due to corticosteroid administration, which have prolonged the autonomous ambulation and the respiratory function. A number of clinical trials (Phase I-IV) are underway, often based on personalized medicine, but still final results have to come. Among these, Eteplirsen (ExonDys51) and Translarna (Ataluren) have received provisional approval as orphan drugs. Circadian rhythm coordinates biological processes with the 24h cycle; its role in maintaining muscle functions is known, both in animal models and in humans. Methods: In order to explore the role of circadian genes in DMD, we designed a low density micro fluidic card-TaqMan based assay, named Fluid-CIRC, including 30 genes related to circadian rhythms and muscle regeneration. These genes were prioritized also based on previous works that documented that circadian genes (Clock) are deregulated in other muscular diseases. We tested gastrocnemius and tibialis anterior muscles from unexercised and exercised mdx mice, these latter both untreated and treated with different drugs currently under active evaluation for their positive effects in the disease. We prioritized the 7 most deregulated genes and performed expression analysis by TaqMan assays in 10 DMD patients with different mutations. We also designed three ELISA antibody-based assays to dose the three mostly deregulated genes (CSNK1ɛ, SIRT1, MYOG) in DMD plasmas. Results: circadian genes were profoundly deregulated in mdx mice, both exercised and unexercised. In untrained mdx mice more than 90% of genes were down-regulated, both in GC and in TA, with the exception of MyoG, Tim and Tgfb1. MyoG, a muscle-specific transcriptional factor involved in muscle differentiation, was the most up-regulated one. Tim, is one of the core clock component genes, and its up-regulation was more evident in TA. Tgfb1, is a key factor involved in fibrosis, and a significant up-regulation was seen in GC. Comparing mdx trained vs untrained mice, we observed an opposite behavior. In GC about 100% of the genes were up-regulated; on the contrary, in TA almost all genes were down-regulated. This peculiar behavior could be explained with the different function and fiber type composition of the two muscles. Among all analyzed genes we selected 7 most de-regulated ones and tested them in treated mdx mice. A trend toward a normalization was clearly evident in all transcripts for almost all the compounds. Only Cry2 was up-regulated but this could possibly be due to the re-established oscillatory pathway of clock core genes. The 7 selected genes were subsequently investigated in muscle biopsies from 10 DMD patients. Most up-regulated genes were CSNK1ɛ, SIRT1, MYOG. In order to explore if such transcript deregulation reflects on protein, we designed an ELISA assay for the up-regulated CSNK1ɛ protein and tested 14 DMD, 2 BMD and 5 male control plasma samples. The CSNK1ɛ showed a variable plasma levels profile however, the sample’s cohort proves to be rather limited and an enlargement of samples number is needed. Conclusion: our data demonstrate for the first time that circadian genes are affected in mdx mice. Arntl, cry1, cry2, sirt1, csnk1ɛ, myod and myog were prioritized and confirmed to be affected also in DMD patients, where MYOG, SIRT1 and CSNK1ɛ were found to be greatly up-regulated. This could suggest a possible role as disease severity biomarkers but a cohort enlargement, including BMD patients, is needed. Furthermore, the normalization trend of all transcripts seen in treated mdx opens the way for the validation of these genes as drug response and monitoring biomarkers for treatments currently under development.
TRANSCRIPTIONAL PROFILING IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY REVEALED A PROFOUND DEREGULATION OF BOTH CIRCADIAN RHYTHM GENES AND GENES INVOLVED IN MUSCLE REGENERATIVE PROCESS AS POSSIBLE NEW DISEASE BIOMARKERS
ARMAROLI, Annarita
2017
Abstract
Introduzione: la distrofina muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria grave. Essa è causata da mutazioni del gene DMD che portano all’assenza della proteina distrofina. Diverse terapie sono state sviluppate finora e alcune si sono rivelate efficaci nel migliorare il decorso clinico, in particolare grazie all’ uso di corticosteroidi che hanno prolungato la fase di deambulazione e migliorato la funzione respiratoria. Vari studi clinici (fase I-IV) sono in corso, spesso basati su approcci di medicina personalizzata, ma i risultati non sono ancora disponibili. Tra questi, Eteplirsen (Exon51Dys) e Translarna (Ataluren) hanno avuto l’approvazione come farmaci orfani. Il ritmo circadiano coordina i processi biologici con il caratteristico ciclo di 24h; il suo ruolo nel regolare le funzioni muscolari è noto sia negli animali che nell’uomo. Metodi: allo scopo di studiare il ruolo dei geni del ritmo circadiano nella DMD, abbiamo disegnato ad hoc una micro fluidic card basata su sistemi TaqMan (Fluid-CIRC), che comprende 30 geni del ritmo circadiano e della rigenerazione muscolare. Tali geni sono stati selezionati anche in base a precedenti dati che hanno mostrato che i geni circadiani (Clock) sono deregolati in altre malattie muscolari. Abbiamo analizzato i muscoli gastrocnemio e tibiale anteriore di topi mdx, esercitati e non, e dei primi, sia muscoli non trattati che trattati con composti in corso di valutazione per i loro effetti sulla malattia. Abbiamo poi selezionato i 7 geni più alterati ed analizzata l’espressione con sistemi TaqMan in 10 DMD. Abbiamo inoltre disegnato tre sistemi ELISA per dosare i geni maggiormente up-regolati (CSNK1ɛ, SIRT1, MYOG) nel plasma di DMD. Risultati: i geni circadiani hanno mostrato una profonda de-regolazione negli mdx, sia esercitati che non. Nei non esercitati più del 90% dei geni era down-regolato, sia nel GC che nel TA, fatta eccezione per MyoG, Tim e Tgfb1. MyoG, un fattore di trascrizione muscolare, coinvolto nel differenziamento, era il maggiormente up-regolato. Tim è uno dei geni circadiani e la sua up-regolazione era più evidente nel TA. Tgfb1 è un fattore chiave del processo di fibrosi, e una sua up-regolazione era più evidente nel GC. Il confronto tra non esercitati ed esercitati seguiva un comportamento opposto nei due muscoli. Mentre nel GC circa il 100% dei geni era up-regolato, nel TA tutti i geni erano down-regolati. Questo peculiare comportamento può trovare ragione nella diversa funzione dei due muscoli. Tra i geni analizzati abbiamo poi selezionato i 7 maggiormente de-regolati ed analizzata l’espressione nei topi trattati. Una tendenza verso la normalizzazione era evidente per tutti i trascritti e tutti i composti. I 7 geni selezionati sono stati analizzati in biopsie di 10 pazienti DMD. I geni maggiormente up-regolati erano CSNK1ɛ, SIRT1 e MYOG. Allo scopo di esplorare se tale de-regolazione potesse riflettersi anche a livello proteico, abbiamo disegnato un sistema ELISA per la proteina CSNK1ɛ ed analizzato il plasma di 14 DMD, 2 BMD e 5 controlli. CSNK1ɛ ha mostrato livelli plasmatici variabili ma la coorte di studio è limitata ed un’espansione del numero di pazienti è necessaria. Conclusioni: i dati dimostrano per la prima volta che l’espressione dei geni circadiani è alterata nel topo mdx. Arntl, cry1, cry2, sirt1, csnk1ɛ, myod e myog sono stati prioritizzati e confermati per essere affetti anche in pazienti DMD; MYOG, SIRT1 e CSNK1ɛ sono stati identificati come i maggiormente up-regolati. Ciò suggerisce un possibile ruolo come biomarcatori di severità clinica tuttavia un allargamento della coorte di studio, includendo BMD, è necessaria. Inoltre, il trend verso la normalizzazione di tutti i trascritti osservata nei topi mdx trattati apre interessanti prospettive per la validazione di tali geni come biomarcatori di efficacia per le nuove terapie in via di sviluppo.File | Dimensione | Formato | |
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