From batch to continuous chromatography for the purification of therapeutic peptides, with particular emphasis on Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification (MCSGP)

Recentemente, il mercato dei biopharmaceuticals si è espanso notevolmente. La cromatografia preparativa a singola colonna (batch) è attualmente la tecnica più usata industrialmente per la purificazione di principi attivi. Generalmente, l’approccio seguito per mettere a punto le condizioni operative è di tipo trial-and-error, che però implica sprechi di tempo e di campione. Al contrario, studi teorici di cromatografia, come gli equilibri termodinamici che regolano l’adsorbimento, permettono di predire la forma dei picchi sperimentali, anche in sistemi multi-componenti e anche al variare delle condizioni sperimentali. Di conseguenza, queste informazioni dovrebbero essere usate nelle fasi di sviluppo di processo. Inoltre, grazie ai recenti avanzamenti nei metodi computazionali e nei modelli teorici, è possibile predire il comportamento termodinamico di un composto in diverse condizioni sperimentali, partendo da pochissime misure sperimentali, impiegando quindi esigue quantità di campione. Questo fattore risulta determinante quando si ha a che fare con campioni molto costosi, come nel caso delle biomolecole. La produzione dei biopharmaceuticals non porta solo alla molecola target, ma anche a una serie di impurezze chimicamente simili al prodotto d'interesse. Di conseguenza il loro comportamento a livello cromatografico risulta simile alla specie che si vuole isolare, e ciò causa la sovrapposizione del picco principale con i picchi di alcune impurezze, difficili da separare. Per migliorare la separazione è spesso necessario, ma talvolta non sufficiente, lavorare in gradiente. Con questi presupposti, la cromatografia in batch su scala preparativa mostra lo svantaggio intrinseco di un trade-off tra purezza e resa. In pratica, quando si raccoglie il prodotto, esso può presentare o una elevata purezza o una elevata resa, a seconda dell’ampiezza della finestra raccolta. Più ampia è la finestra, maggiore è la resa, ma maggiore è anche il rischio di raccogliere impurezze che coeluiscono con la testa o la coda del picco. Di conseguenza, le regioni in cui il picco target coeluisce con altre specie devono essere riciclate, cioè riprocessate, all’interno dello strumento, operazione che viene compiuta manualmente da un operatore. Lo scopo di questa tesi è fornire un ponte tra le conoscenze cromatografiche teoriche e le applicazioni tecnologiche nell’ambito della purificazione di biopharmaceuticals su scala industriale. Nello specifico, questo lavoro è incentrato su un processo cromatografico in continuo chiamato MCSGP (Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification). Le sue caratteristiche, ovvero la possibilità di lavorare in continuo su due colonne e di operare in diverse condizioni sperimentali anche in gradiente, lo rendono uno strumento molto potente per la purificazione di biopharmaceuticals. Sfruttando i principi della cromatografia countercurrent ed effettuando automaticamente il riciclo interno delle porzioni di picco contaminate dalle impurezze, l’MCSGP permette di superare il trade-off tra purezza e resa tipico della cromatografia batch. Infine, la completa automatizzazione del processo di purificazione usando la tecnica MCSGP permette di muoversi nella direzione dell’Industria 4.0. Durante il mio programma di dottorato ho considerato dapprima i fondamenti di cromatografia non lineare, fino ad arrivare al set-up dello strumento MCSGP e alle corse sperimentali in continuo, nei laboratori del Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche dell’Università di Ferrara. Il processo è stato applicato a diversi crudi peptidici di interesse industriale. Il confronto tra i processi batch ed MCSGP per la purificazione di peptidi ha rivelato le grandi potenzialità della tecnica in continuo in termini di performance. Questa tesi è il risultato della collaborazione con Fresenius Kabi iPSUM (Villadose, Rovigo, IT) e con il gruppo di ricerca del Prof. Morbidelli (Politecnico di Milano, IT).

The market of biopharmaceuticals has considerably expanded in the last years and it is expected to grow more and last longer in time. Preparative chromatography operated in batch or single-column mode is by far the most employed technique for the purification of pharmaceuticals at the industrial level. Very often, the approach followed to find the best operative conditions relies on trials-and-errors, with waste of time and feed. On the opposite, the theory of chromatography allows to predict the shape of experimental peaks based on the knowledge of thermodynamic equilibria regulating the adsorption. Thus, this information can (and should) be used to drive method development. In addition, thanks to recent advances in numerical methods and theoretical models (e.g., the so-called Inverse methods), the thermodynamic behavior of a compound can be fully predicted under a variety of experimental conditions (including isocratic and gradient ones) starting from very few experimental chromatograms, meaning with a very little amount of materials. The industrial production of biopharmaceuticals (e.g., peptides, proteins, oligonucleotides) does not lead to the target molecule only. Independently from the upstream procedure, indeed, many impurities are also usually produced, the removal of which is challenging since usually their chromatographic behavior is very similar to that of the target, leading to overlapping regions in the chromatogram where target and impurities co-elute. Under these conditions, batch chromatography on preparative (or semi-preparative) scale has the intrinsic disadvantage of the purity-recovery trade-off. It means that, when the target product is collected, it can be obtained either with high purity or high recovery, depending on the width of the window to pool. The larger this window, the higher the recovery but the greater the risk to lose in purity, due to the presence of co-eluting impurities. Therefore, the sides of the main peak co-eluting with impurities need to be reprocessed, an operation which is usually performed (discontinuously) by an operator. The scope of this thesis is to contribute to fill the gap between theoretical knowledge, technical innovation and technology transferring in the field of industrial scale production of biopharmaceuticals. In particular, this work revolves around a continuous chromatographic process called Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification (MCSGP). Thanks to its intrinsic properties – namely, the possibility to work on a twin-column unit and to operate different gradient programs – this process is a formidable tool in the hands of chemists and chemical engineers for the purification of biopharmaceuticals. By exploiting the principles of countercurrent chromatography and, meantime, by allowing for the internal recycling of the portions of the main peak contaminated with impurities, MCSGP permits indeed to overcome the above mentioned purity-recovery trade-off. Last but not least, in an MCSGP experiment the complete automation of the purification process can be realized, grasping thus the directions and requirements of Industry 4.0. During my PhD program, I went through different steps. They include the study of fundamentals of nonlinear chromatography till the setting-up and running of the equipment to perform MCSGP, in the laboratories of the Department of Chemistry and Pharmaceutical Sciences of the University of Ferrara (Ferrara, Italy). The process was applied to several crude peptide mixtures of industrial interest. The comparison between MCSGP and batch processes for the purification of peptides, has revealed the great potentiality of the former technique in terms of process performance (in order of importance: purity, recovery, productivity and solvent consumption). This thesis is the result of a tight collaboration with Fresenius Kabi iPSUM (Villadose, Rovigo, IT) and with Professor Morbidelli's research group (Politecnico di Milano, IT).