Innovative approaches for molecular diagnosis of genetic diseases

La diagnosi di patologie genetiche fetali viene effettuata a partire da materiale biologico prelevato tramite tecniche invasive, le quali presentano un elevato rischio di aborto. La diagnosi prenatale non invasiva, effettuata a partire da ccffDNA (DNA circolante fetale), isolato da sangue materno, negli ultimi anni, ha avuto una crescita esponenziale. La diagnosi del sesso, in età prenatale, permette di definire il rischio di malattie legate al cromosoma X. La prima parte della tesi ha come obbiettivo, quindi, lo sviluppo di approcci diagnostici molecolari non invasivi, rapidi e sensibili per la determinazione del sesso fetale, in particolare a settimane di gestazione precoci. Per verificare la presenza del gene SRY, sul cromosoma Y, nel ccffDNA, estratto da plasma materno, è stata impiegata, in primis, la Real Time PCR. I risultati hanno confermato il limite di rilevabilità della tecnica (9 settimane) individuato in uno studio preliminare del gruppo di ricerca. Per settimane di gestazione precoci è stata impiegata la tecnologia innovativa digital droplet PCR (ddPCR): dopo aver ottimizzato le condizioni sperimentali, sono stati analizzati campioni a settimane di gestazione comprese fra le 12 e le 4.5, e per tutti la tecnica si è dimostrata accurata al 100% nel determinare correttamente il sesso fetale. La β talassemia è una patologia autosomica recessiva associata all’assenza o riduzione delle catene β globiniche dell’emoglobina. I soggetti che presentano la forma più severa della patologia non possono sopravvivere senza trasfusioni associate a ferrochelanti. L’unico vero trattamento definitivo è il trapianto di midollo, il quale però è associato a forti rischi. Sono stati studiati, quindi, approcci terapeutici innovativi con l’obbiettivo di una terapia personalizzata. L’identificazione della specifica alterazione molecolare è, quindi, di fondamentale importanza al fine di scegliere la corretta strategia terapeutica. La seconda parte della ricerca ha, quindi, come obbiettivo lo sviluppo di approcci molecolari diagnostici pre- e postnatali rapidi, sensibili e poco costosi per l’identificazione delle più frequenti mutazioni talassemiche nel Mediterraneo (β039, β+IVSI-110, β+IVSI-6, β0IVSI-1). Per la diagnosi postnatale, è stata impiegata, in primis, la tecnologia BiacoreTM: una sonda mutata e normale sono state immobilizzate sul chip, validate e, successivamente, è stato estratto il DNA genomico di soggetti sani e pazienti omozigoti ed eterozigoti per le mutazioni considerate, ed effettuata l’analisi. Per tutti i campioni analizzati è stato possibile discriminare il diverso genotipo. Un secondo approccio ha previsto il disegno di saggi di genotipizzazione da utilizzare in Real Time PCR. Ottimizzati e validati, i saggi hanno permesso una corretta diagnosi di tutti i pazienti considerati. Lo stesso approccio, basato sui saggi di genotipizzazione, è stato utilizzato per la diagnosi prenatale delle mutazioni ereditate per via paterna. I campioni di ccffDNA sono stati preamplificati e analizzati, mostrando come questo approccio sia stato in grado di identificare il genotipo fetale a partire dalla nona settimana di gestazione. Per poter estendere la diagnosi prenatale a settimane di gestazione precoci e a mutazioni ereditate sia per via materna che da entrambi i genitori è stata utilizzata la ddPCR come approccio molecolare. I saggi di genotipizzazione per le mutazioni β039 e β+IVSI-110 sono stati ottimizzati, validati e utilizzati per l’analisi del ccffDNA. Per tutti i campioni in cui la mutazione è ereditata per via paterna, il genotipo fetale è stato correttamente individuato fino alla quinta settimana di gestazione. Per i campioni in cui solo la madre o entrambi i genitori sono portatori, è stato possibile individuare due intervalli, sulla base del rapporto fra allele mutato e normale, statisticamente separati, necessari per considerare il feto non portatore o eterozigote.

The diagnosis of genetic diseases in fetal age is obtained using invasive procedures, but these hide a high risk of miscarriage. Recently, non-invasive pre-natal diagnosis, based on circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) analysis starting from a simple maternal peripheral blood sampling, has become increasingly important. The fetal sex determination is necessary for predicting the risk of X-linked disorders. Against this background, the principal purpose of the first part of the research was the development of rapid and sensitive non-invasive diagnostic methods for the fetal sex determination, in particular at early gestational ages. In order to detect the SRY gene on Y chromosome, in ccffDNA samples extracted from maternal plasma, the quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) was first employed. The obtained results confirmed that the fetal sex determination can correctly performed from the 9th gestational week, as shown in an already reported study. The innovative technology digital droplet PCR (ddPCR) was applied to non-invasive sex diagnosis at early gestational ages: after optimizing the experimental conditions, ccffDNA samples at early gestational stages (12-4.5 weeks) were analysed, and for all of them the fetal gender was correctly determined achieving 100% accuracy. β thalassemia is an autosomal recessive inherited disease associated with the absence (β0) or reduction (β+) of adult hemoglobin β chains. β thalassemia major is the most severe form of the disease, in fact, patients are unable to survive into adulthood without a therapeutic transfusion plan associated with iron chelation. The only definitive treatment is the bone marrow transplantation, which hides transplant-related complications. So, innovative therapeutic approaches are been investigated in order to employ a personalized therapy. For this reason, the detection of the specific pathogenic molecular alteration is crucial for the employment of the correct targeted and personalized therapy. Therefore, the aim of the second part of the research was the development of rapid, sensitive and cost-effective pre- and post-natal diagnostic approaches for the identification of the four most common mutations causing β thalassemia in the Mediterranean area (β039, β+IVSI-110, β0IVSI-1, β+IVSI-6). The first technique employed, for post-natal diagnosis, was BiacoreTM system: after the immobilization and the validation of a normal and a mutated probes on the instrument chip, the diagnosis was performed from single-stranded PCR products, obtained from genomic DNA of healthy subjects and heterozygous and homozygous patients. For all the specimens, it was possible to correctly discriminate the genotype. Another post-natal approach employed the qRT-PCR based on genotyping assays. After the optimization and the validation, the assays allowed the correct molecular diagnosis. The same approach, based on genotyping assays, was applied to non-invasive pre-natal screening of the paternally inherited mutations. The ccffDNA samples were pre-amplified and analysed showing that the developed genotyping assays could be efficiently employed for non-invasive pre-natal diagnosis of paternally inherited β thalassemia mutations, at least until the 9th gestational week. In order to extend the diagnosis to earlier pregnancy and to maternally or both maternally and paternally inherited mutations, the ddPCR technology had been proposed as molecular approach. β039 and β+IVSI-110 genotyping assays were optimized, validated and employed for the analysis. For all the samples, in which the mutation was paternally inherited, the fetal genotype was correctly determined, also at 5th gestational week. For the samples in which the mutation was maternally or both parents inherited, two diagnostic ranges of allelic ratio values were identified. They were statistically distinct and not overlapping, allowing the correctly determination of fetal genotype.