Role of the P2X7 receptor in radiation therapy response and resistance in glioblastoma multiforme

Introduzione Il glioblastoma multiforme (GBM) è il più aggressivo tra i tumori cerebrali primari che colpiscono l’adulto. Attualmente il gold standard per il trattamento dei pazienti affetti da GBM è la resezione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia con temozolomide. Nonostante ciò, la sopravvivenza media per i pazienti è di 12-18 mesi, con la maggior parte dei pazienti deceduti entro due anni dalla diagnosi. Il microambiente tumorale (TME) è ricco di nucleotidi e nucleosidi e la sua composizione cellulare e biochimica influenza la progressione del tumore, i processi di metastatizzazione e la risposta alla terapia. In particolare, l’ATP, una essenziale moneta energetica e un importante messaggero extracellulare, può essere rilasciato nello spazio extracellulare mediante pathways multipli e come damage-associated molecular pattern (DAMP) dopo chemio e radioterapia. Tra i recettori di tipo P2 che possono essere attivati dall’ATP, il recettore P2X7 (P2X7R) è il più interessante. In base al livello di attivazione, alla isoforma e alla tipologia cellulare, il P2X7 può attivare meccanismi di sopravvivenza cellulare o di apoptosi. L’obiettivo di questo studio è indagare il ruolo del P2X7R nei meccanismi di radioresistenza nel GBM. Metodi L’espressione delle isoforme di splicing del P2X7R è stata valutata su cellule di GBM derivate da paziente mediante Digital PCR, Real-Time PCR e Western Blot. L’attività funzionale del P2X7R è stata valutante mediante misurazione della concentrazione citoplasmatica di calcio e mediante misurazione dell’uptake di etidio bromide. Le cellule di GBM sono state esposte a una dose di radiazione di 7.5Gy e sono state trattate con due antagonisti di P2X7R. Gli effetti citotossici e la crescita cellulare sono stati valutati mediante test clonogenico e mediante rilascio di lattato deidrogenasi. Il fenotipo senescente delle cellule di GBM dopo trattamento radiante è stato individuato utilizzando il saggio della β-Galattosidasi. La concentrazione totale di colesterolo è stata quantificata in cellule di GBM trattate e non con radioterapia utilizzando l’AmplexTM Red Cholesterol Assay Kit. L’attività della caspasi 1 è stata quantificata mediante l’utilizzo del Caspase- Glo® 1 Inflammasome Assay Kit. Risultati I livelli di espressione e la funzionalità del P2X7R incidono sulla risposta al trattamento radiante in termini di inibizione della crescita cellulare e induzione di morte cellulare. Il trattamento combinato radioterapia e antagonisti contro P2X7R incrementano i livelli di morte cellulare. Le cellule di GBM radio-resistenti sviluppano un fenotipo senescente in cui l’isoforma B del P2X7R è più espressa, la concentrazione di colesterolo di membrana è incrementata e la caspasi-1 è attivata. Questi elementi insieme sembrano contribuire al recovery delle cellule di GBM dopo trattamento radiante. Conclusioni I nostri dati suggeriscono che le cellule di GBM sono in grado di adattarsi al microambiente dopo trattamento radiante, cercando di evitare la morte cellulare modificando il signaling purinergico e alterando la funzionalità del P2X7R.

Background Glioblastoma multiforme (GBM) is the most malignant and aggressive primary adult brain tumor. The current standard of care for GBM patients is surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy with temozolomide. Despite this, the median survival for patients with GBM tumor is 12-18 months and the majority of GBM patients die within two years. Tumor microenvironment (TME) is enriched in nucleosides and nucleotides and its cellular and biochemical composition affects tumor progression, metastatic spread, and response to therapy. In particular, ATP, a key energy currency and an important ubiquitous extracellular messenger, can be released into the extracellular space via multiple pathways and as a damage-associated molecular pattern (DAMP) after chemo- and radiotherapy. Among the P2 receptors engaged by extracellular ATP, P2X7 is the most intriguing. Depending on the level of activation, isoform and cell type, P2X7 can lead to cell survival or apoptosis. In the present study we aimed to explore the role of P2X7R in the radioresistance of GBM cells. Methods P2X7R isoforms expression was evaluated by Real-Time PCR and Western Blot on patient-derived GBM cells. Functional response of P2X7R was performed on GBM cells evaluating cytosolic calcium concentration and ethidium bromide uptake. GBM cells were exposed to 7.5Gy radiation dose and treated with P2X7R antagonists. Effects on cell growth and cytotoxicity was evaluated trough clonogenic assay and lactate dehydrogenase release respectively. β-Gal assay was used to evaluate senescence phenotype after radiation treatment. The total amount of cholesterol in both treated and non-treated GBM cells was evaluated by Amplex™ Red Cholesterol Assay Kit. Inflammasome caspase-1 activity was evaluated with Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay. Results The P2X7R expression levels and its functionality affect the GBM cell response to radiation treatment in terms of cell growth inhibition and cell death induction. Radiation coupled with P2X7R antagonists increases cells death. GBM radio-resistant cells undergo a senescence phenotypic state in which P2X7R isoform B is overexpressed, membrane cholesterol is increased and inflammasome caspase-1 is activated, contributing to cells recovery after radiation treatment. Conclusions Our finding suggests that GBM cells adapt to thrive in microenvironment after radiotherapy escaping cell death also by shaping purinergic signaling through the alteration of P2X7R functionality.