Glucocorticoid modulation of the innate antiviral immune response in bronchial epithelial cells

I corticosteroidi inalatori (ICS), da soli o in combinazione con agonisti β2 adrenergici a lunga durata (LABA) sono farmaci in uso per il trattamento di disordini polmonari cronici quali asma e BPCO. Il rinovirus (RV) è il virus più frequentemente rilevato durante le esacerbazioni. L’effetto del glucocorticoide (GC) standard Fluticasone propionato (FP) e degli agonisti (GRT10) e modulatori (GRT7 and GRT8) selettivi del recettore dei glucocorticoidi (GR) sulle risposte pro-infiammatoria e immunitaria antivirale è stato indagato su cellule epiteliali bronchiali (BEAS2B) infettate in vitro con rinovirus umano 1B (HRV-1B). La soppressione del rilascio delle citochine pro-infiammatorie IL-6 [FP (IC50=0.4nM); GRT7 (IC50=0.3nM); GRT8 (IC50=106nM); GRT10 (IC50=1nM)] e IL-8 [FP (IC50=0.2nM); GRT7 (IC50=0.2nM); GRT8 (IC50=29nM); GRT10 (IC50=0.5nM)] e della citochina antivirale IL-29/IFNλ1 [FP (IC50=0.6nM); GRT7 (IC50=0.4nM); GRT10 (IC50=1nM)] è stata misurata tramite ELISA. Il composto GRT8 non ha influenzato la produzione di IFNλ1, mostrando un profilo farmacologico differente. L’espressione di geni stimolati da interferone (ISG) e la replicazione virale sono state quantificate mediante qRT-PCR. A 15nM tutti i composti testati hanno soppresso viperin [FP (75%); GRT7 (62%); GRT8 (40%); GRT10 (58%)] e OAS [FP (54%); GRT7 (34%); GRT8 (53%); GRT10 (41%)] rispetto a DMSO. FP, GR7 and GRT10 hanno inoltre aumentato il genoma virale in maniera dose dipendente (~2 volte a 62nM), mentre nessun effetto è stato osservato con GRT8. In aggiunta, determinando il titolo finale (TCID50) virale, è stato osservato un incremento dovuto a FP (2.5 volte) e GRT7 (1.7 volte) ma non a GRT8 e GRT10 a 250nM. Pertanto è stato dimostrato l’atteso effetto anti-infiammatorio di FP, oltre che dei composti selettivi per GR, assieme al totale o parziale indebolimento della risposta immunitaria antivirale innata indotta da RV. Il risultato è una accresciuta replicazione virale, ad eccezione di GRT8. Il segnale attivato da IFN di tipo I è stato inoltre indagato. Cellule BEAS2B non infettate sono state stimolate con IFN-β ricombinante. A 50nM tutti i composti testati hanno soppresso l’espressione genica di viperin [FP (46%); GRT7 (42%); GRT8 (53%); GRT10 (41%)] e OAS [FP (51%); GRT7 (38%); GRT8 (42%); GRT10 (34%)] rispetto al controllo, tramite qRT-PCR. In aggiunta, specifiche fosforilazioni su residui tirosinici (Y) di STAT1 (pSTAT1 Y701) e STAT2 (pSTAT2 Y690) sono state rivelate tramite WB. La rapida (entro 30 o 60 minuti) inibizione di pSTAT1 Y701 e pSTAT2 Y690, a partire da basse dosi (0.1-1nM) e perfino senza pretrattamento, suggerisce che il GC standard FP e i composti selettivi GRT7, GRT8 e GRT10 interferiscono con il segnale JAK/STAT attivato. Nessuna induzione da IFN-β e nessuna inibizione da GC è stata osservata con FP su pSTAT1 S727. L’effetto degli steroidi standard Budesonide (Bud) e Dexametasone (Dex), rispettivamente somministrati come ICS e OCS, in aggiunta al LABA Formoterol (Form), è stato valutato mediante qRT-PCR in cellule BEAS2B infettate con RV. A 1nM Bud ha soppresso viperin (92%) similmente a Dex (75%), mentre Form ha soppresso viperin con minore entità (60%) e ad una dose più alta (10nM). Bud ha inoltre soppresso OAS (82%) similmente a Dex (45%) a 1nM, mentre Form ha soppresso OAS con minore entità (45%) a 10nM. Form non ha avuto effetto sulla replicazione del genoma virale, mentre un incremento di HRV-1B RNA è stato dimostrato con Bud (1.5 volte) a 10nM e Dex (1.9 volte) a 100nM. Le combinazioni (Bud0.1nM/Form10nM) o (Bud0.5nM/Form10nM) sono state inoltre testate. Un effetto potenziato sulla soppressione di viperin e OAS con (Bud0.1nM/Form10nM) ma non con (Bud0.5nM/Form10nM) è stato osservato rispetto a Bud e Form da soli, suggerendo un potenziale beneficio con la riduzione delle dosi di ICS nella terapia combinata ICS/LABA.

Inhaled corticosteroids (ICS), alone or in combination with long acting β2 adrenergic agonists (LABA) are widely prescribed medications for the treatment of chronic pulmonary disorders such as asthma and COPD. Rhinovirus (RV) is the most frequently detected virus during exacerbations. The effect of the standard glucocorticoid (GC) Fluticasone propionate (FP) and selective glucocorticoid receptor (GR) agonists (GRT10) and modulators (GRT7 and GRT8) on pro-inflammatory and antiviral immune responses was investigated in an in vitro model of bronchial epithelial cells (BEAS2B) infected with human rhinovirus 1B (HRV-1B). The suppression of pro-inflammatory cytokines IL-6 [FP (IC50=0.4nM); GRT7 (IC50=0.3nM); GRT8 (IC50=106nM); GRT10 (IC50=1nM)] and IL-8 [FP (IC50=0.2nM); GRT7 (IC50=0.2nM); GRT8 (IC50=29nM); GRT10 (IC50=0.5nM)] and antiviral cytokine IL-29/IFNλ1 [FP (IC50=0.6nM); GRT7 (IC50=0.4nM); GRT10 (IC50=1nM)] release was assessed by ELISA. Compound GRT8 did not affect IFNλ1 production, showing a different pharmacological profile relative to FP, GRT7 and GRT10. Dose-responsive interferon stimulated gene (ISG) expression was quantified by qRT-PCR. At a concentration of 15nM all tested compounds suppressed viperin [FP (75%); GRT7 (62%); GRT8 (40%); GRT10 (58%)] and OAS [FP (54%); GRT7 (34%); GRT8 (53%); GRT10 (41%)] relative to DMSO. FP, GR7 and GRT10 also increased viral genome replication in a dose-dependent way (~2-fold each at 62nM) by qRT-PCR, whereas no effect was observed with GRT8. In addition, RV replication was measured by endpoint titre determination (TCID50). The viral titre was increased by FP (2.5-fold) and GRT7 (1.7-fold) but unaffected by GRT8 and GRT10 at a concentration of 250nM. Thus, the expected anti-inflammatory effect of FP and also of selective GR ligands was demonstrated, together with a total or partial impairment of RV-induced innate antiviral immune response, which results in an increased viral replication, except with GRT8. The type I IFN signalling pathway was also explored. Uninfected BEAS2B cells were stimulated with recombinant IFN-β and qRT-PCR and WB analyses performed to assess ISG expression and JAK/STAT activation, respectively. At a concentration of 50nM all tested compounds suppressed viperin [FP (46%); GRT7 (42%); GRT8 (53%); GRT10 (41%)] and OAS [FP (51%); GRT7 (38%); GRT8 (42%); GRT10 (34%)] gene expression relative to control. Specific phosphorylations of STAT1 (pSTAT1 Y701) and STAT2 (pSTAT2 Y690) at tyrosine (Y) residues were also detected. The rapid (within 30 or 60 minutes) inhibition of pSTAT1 Y701 and pSTAT2 Y690, starting from low doses (0.1-1nM) and even without pre-treatment, suggests the standard glucocorticoid FP and selective compounds GRT7, GRT8 and GRT10 interfere with the activated JAK/STAT pathway. No IFN-β induction and no GC inhibition of pSTAT1 serine S727 was observed with FP. The effect of Budesonide (Bud) and Dexamethasone (Dex), other two standard steroids, clinically administered as ICS and oral corticosteroid (OCS), respectively, in addition to the β2 adrenergic agonist Formoterol (Form), was assessed in RV-infected BEAS2B cells by qRT-PCR. At 1nM concentration, Bud suppressed viperin (92%) similarly to Dex (75%), while Form suppressed viperin to a lesser extent (60%) and at a higher dose (10nM). Bud also suppressed OAS (82%) similarly to Dex (45%) at 1nM concentration, while Form suppressed OAS to a weaker magnitude (45%) at 10nM. Form had no effect on viral genome replication, whereas an increase of HRV-1B RNA was demonstrated with Bud (1.5-fold) at 10nM and Dex (1.9-fold) at 100nM. The combinations (Bud0.1nM/Form10nM) or (Bud0.5nM/Form10nM) were also tested. A potentiated effect on viperin and OAS suppression with (Bud0.1nM/Form10nM) but not with (Bud0.5nM/Form10nM), compared to Bud and Form alone, was observed, suggesting that a reduction of ICS doses in ICS/LABA combinatorial therapy may be beneficial.