Genomic, vessel wall transcriptomic, and plasma proteomic approaches to investigate multiple sclerosis

Questo studio è stato progettato per indagare attraverso diversi approcci sperimentali i geni e le proteine associate alla sclerosi multipla (SM), una malattia infiammatoria e demielinizzante del sistema nervoso centrale (SNC). L’obiettivo era individuare mediante indagini su pazienti, potenziali bersagli e biomarcatori per futuri studi meccanicistici. Mediante l'approccio genomico(cap.10), le famiglie selezionate sono state studiate attraverso WES per geni candidati da GWAS. Gli SNPs identificati a bassa frequenza sono stati ulteriormente studiati in pazienti indipendenti con SM. L’indagine ha rilevato varianti rare e nuove, tra cui le nulle della regione 3' di C6orf10 in combinazione con SNPs a bassa frequenza a livello intra ed extra locus, fornendo le basi per studi di espressione. L'approccio trascrittomico(cap.6) focalizzato sulla parete interna della vena giugulare, era supportato dall'interazione tra i meccanismi vascolari e quelli neurodegenerativi nella SM. Questa indagine ha prodotto una grande quantità di informazioni su diversi percorsi biologici e ha permesso l'analisi combinata trascrittoma-proteine. L'analisi a livello proteico è stata condotta nel plasma mediante saggi multiplex in relazione ai fenotipi clinici di SM e alle misure cerebrali MRI considerate come fenotipi quantitativi e "intermedi" della progressione della malattia. I livelli plasmatici più alti di CCL18 erano associati a caratteristiche neurodegenerative più gravi(cap.7). Il contributo delle molecole di adesione, suggerito dall'analisi trascrittomica, è stato esplorato in modo analogo(cap.8 e 9). La correlazione tra i livelli plasmatici di specifiche molecole di adesione nei pazienti ha evidenziato il processo di adesione dei leucociti nella malattia. L'aumento della permeabilità della barriera emato-encefalica, evento chiave nella fisiopatologia della SM, porta all’irruzione di fattori emostatici nel SNC, causando una risposta infiammatoria e l’attivazione immunitaria. I componenti dell'emostasi con le principali domande aperte in relazione alla SM sono stati investigati. Il FXII, la proteasi attivatrice della coagulazione da contatto trovata depositata nel cervello dei pazienti, potrebbe partecipare all'immunità adattativa durante la neuroinfiammazione. Nel plasma di pazienti(cap.4) i livelli di proteina del FXII erano superiori all'attività, causando un ridotto rapporto attività/antigene. I risultati corroborati dai saggi di generazione intrinseca di trombina, supporterebbero il contributo del FXII nella SM non attraverso la sua attività pro-coagulante. Lo studio di alcuni inibitori dell'emostasi (TFPI, ADAMTS13, HCII, TM) con proprietà antinfiammatorie, ha rivelato specifici schemi di correlazione(cap.5 e 11). L'associazione positiva di TFPI con TM, osservata nei pazienti e non in soggetti sani, implicherebbe che la perturbazione dell'endotelio agisca su più meccanismi di rilascio. Nei pazienti il PAI-1, l'inibitore chiave della fibrinolisi, era associato positivamente al FXII e negativamente all'HCII, suggerendo meccanismi patologici che influenzano la loro espressione in diversi tessuti con implicazioni nella generazione di fibrina e nella compromissione della fibrinolisi. Le correlazioni osservate tra i livelli plasmatici dei componenti dell'emostasi con le misure di MRI, non hanno superato la correzione per confronti multipli. La perdita extravascolare di sangue misurata come micro sanguinamenti cerebrali (MSC) attraverso MRI è stata studiata nei pazienti in relazione ai livelli plasmatici di componenti dell'emostasi. Livelli più bassi di ADAMTS13 sono stati rilevati nella coorte di SM ed in particolare nei pazienti con MSC(cap.5) che mostravano anche livelli più alti di VAP-1(cap.9). Queste nuove scoperte supportano l'analisi della proteasi ADAMTS13 e l’aminossidasi/proteina di adesione VAP-1 in relazione ai MSC. Questo studio fornisce nuovi biomarcatori della SM e potenziali bersagli farmacologici

This study was designed to investigate, by several experimental approaches, genes, and proteins associated with multiple sclerosis (MS), an inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). The study design was aimed to prioritize, by the investigation in patients, potential targets and biomarkers for future mechanistic studies. Through the genomic approach(chpt.10), selected families were investigated by WES for candidate genes from GWAS. The identified low-frequency variants were further investigated in unrelated MS patients. A number of rare and novel mutations were detected, and particularly null variants in the C6orf10 3’ region, in combination with both intra and extra locus low-frequency SNPs. These findings provide the bases for expression studies. The transcriptomic approach (chpt.6) was focused on the internal jugular vein wall, supported by the interaction between vascular and neurodegenerative mechanisms in MS. This original investigation produced a wealth of information on several biological pathways and permitted the combined transcriptome-protein analysis, which provided intriguing biological and clinical hints. Analysis at protein level was conducted in plasma by multiplex assays in relation to clinical MS phenotypes and brain MRI measures, as quantitative and “intermediate” phenotypes evaluating disease progression. Higher CCL18 plasma levels were associated with more severe neurodegenerative features, a noticeable finding(chpt.7). The contribution of adhesion molecules, suggested by the transcriptomic analysis, was similarly explored(chpt.8 and 9). Correlation between plasma levels of specific adhesion molecules in MS patients highlights the leukocyte adhesion process in disease. Increased blood-brain-barrier permeability, a key event in the MS pathophysiology, leads to the irruption of coagulation and hemostasis factors into the CNS, potentially causing an inflammatory response and immune activation. We investigated hemostasis components with main open questions in relation to MS. FXII, the key protease of the coagulation contact activation found deposited in patients’ brain, might participate in adaptive immunity during neuroinflammation. In plasma of MS patients(chpt.4), FXII protein levels were higher than activity, causing a decreased activity/antigen ratio. These findings, corroborated by specifically designed intrinsic thrombin generation assays, might support that FXII contribution in MS is not directly correlated with its “intrinsic” pro-coagulant activity. Negative regulators of hemostasis (TFPI, ADAMTS13, HCII, TM) with anti-inflammatory properties were also studied, which detected specific patterns of correlations (chpt.5 and 11). Positive association of TFPI with TM, observed in MS patients and not in healthy subjects, would imply that endothelium perturbation acts on multiple release mechanisms. In patients, PAI-1, the key fibrinolysis inhibitor, was positively associated with FXII, and negatively associated with HCII, which suggest disease mechanisms influencing their expression in different tissues with implications in fibrin generation/impaired fibrinolysis, important contributors to neuro-inflammation/degeneration. Correlations observed between hemostasis components plasma levels and MRI measures, of interest for brain disease mechanisms, did not overcome correction for multiple comparisons. Extravascular leakage of blood components in MS patients, measured as cerebral microbleeds (CMBs) by MRI, was investigated in relation to plasma levels of hemostasis components. Interestingly, lower ADAMTS13 levels were detected in the MS cohort, in particular in patients with CMBs (chpt.5), who also showed higher VAP-1 levels(chpt.9). These novel findings support the investigation of the plasma protease ADAMTS13, and the amino oxidase/adhesion protein VAP-1, in relation to CMBs. This study provides novel MS disease biomarkers as well as potential drug targets