LEISHMANIA: METABOLOMICS, BIOCHEMICAL AND CLINICAL STUDIES

La leishmaniosi viscerale (VL) è un problema sanitario mondiale e i farmaci possono dare tossicità nonché generare resistenza, perciò è importante la ricerca di nuovi composti e nuovi “drug target”. In questa tesi la Leishmania (L) è stata studiata sia dal punto di vista biochimico che clinico. Ho analizzato gli effetti antiproliferativi e metabolici della 6-aminonicotinamide. Essendo riportato come bersaglio principale della 6-AN la via dei pentosi fosfato (PPP), necessaria al sistema di difesa antiossidante della cellula e i cui enzimi in questi parassiti presentano differenze significative con quelli di mammifero, PPP potrebbe rappresentare un buon ”drug target”. Inoltre, poiché un secondo bersaglio potrebbe essere la transglutaminasi (TGasi) riportata essere importante per il parassita, si è cercato di caratterizzarla in L. infantum. Nello studio clinico, si è valutata la prevalenza di parassitosi da L, asintomatiche/subcliniche in pazienti dell’ospedale di Ferrara, affetti da patologie reumatiche autoimmuni, trattati con farmaci immunosoppressori. Promastigoti di L. mexicana e L. infantum sono stati trattati per 24 ore con 6-AN 7,8 mM e dopo estrazione i metaboliti più piccoli sono stati analizzati mediante pHILIC-LC-MS. La TGasi è stata saggiata in vivo in promastigoti di L. infantum e in vitro in lisato cellulare dopo incubazione con fluoresceina-cadaverina. L’attività è stata anche saggiata in micropiastra pure dopo frazionamento con AS. Anticorpi policlonali contro TGasi 2 umana sono stati usati nell’immunocitochimica e in Western Blot di lisati di L. infantum umana e canina e frazioni precipitate. Su DNA estratti da PBMC di 50 pazienti e 50 soggetti sani si sono effettuate PCR qualitativa e real-time. Inoltre si sono quantificate le citochine seriche. Sia in L. mexicana che L. infantum, 6-AN ha causato una diminuzione significativa di fosforibosil-pirofosfato (PRPP) e nicotinato e come conseguenza di nucleotidi mentre le nucleobasi sono aumentate. I livelli di glutatione, ribosio-5-fosfato, 6-fosfogluconato e intermedi PPP a valle erano simili ai controlli. Nei mammiferi la 6-AN è metabolizzata a 6-ANAD/P da una NAD+ glicoidrolasi, ma in L la tossicità solo in concentrazione mM, con deplezione di PRPP e conseguente calo di nucleotidi, indica che 6-AN potrebbe entrare nella via Preiss-Handler di sintesi del NAD+. In L la NAD+ glicoidrolasi potrebbe idrolizzare il NAD+ ma non catalizzare lo scambio tra nicotinamide e 6-AN, come riportato in altri microrganismi. Analisi ulteriori di flusso dopo marcatura con 13C-glucosio potrebbero chiarire il meccanismo d’azione del 6-AN in L. Si è confermata in vivo and in vitro, la presenza in L di una TGasi attiva, in promastigoti canini Ca2+-dipendente e inibita da GTP. Con l’immunocitochimica si è rivelata fluorescenza e nei blot bande di 74.6 KDa per il ceppo canino e di 55.34 e 65.87 KDa per quello umano, suggerendo che gli anticorpi usati potrebbero essere utili nella purificazione dell’enzima. In 18 pazienti si è riscontrata positività ma non evidenziate differenze significative tra possessori o meno di cani e in riferimento al tipo di farmaco somministrato. In tutti i pazienti in trattamento con farmaci biologici, erano significativamente elevate le citochine pro-infiammatorie IL-1, IL-6, IL-12(p70), IL-7, IL-15, IFN-γ e TNF-α, quelle anti- infiammatorie IL-4 e IL-13 e la regolatoria IL-10, ma un aumento maggiore era presente nei pazienti positivi per la presenza di DNA di L. L’alta parassitemia trovata suggerisce che il trattamento possa portare a VL criptica o infezione latente, con possibilità di progressione a VL conclamata in caso di evoluzione a uno stato di immunocompromissione. Si potrebbero quindi introdurre uno screening molecolare su frazioni PBMC e l’analisi di citochine prima di prescrivere questo tipo di farmaci a pazienti con patologie autoimmuni.

Visceral Leishmaniasis (VL) is a major health problem worldwide and both, drugs have toxic effects and parasites developed resistance therefore new compounds and drug targets are sought. In this thesis Leishmania (L) and leishmaniasis were probed both in biochemical and clinical studies. The 6-aminonicotinamide effect was analysed on L parasite growth and metabolism by metabolomics technology. The rational was pentose phosphate pathway (PPP), a major antioxidants provider, has been reported as a 6-AN target and L PPP enzymes have significant differences versus those of the mammals, thus PPP might represent a good target. The other biochemical study was conducted to characterize L transglutaminase (TGase), catalyzing irreversible protein crosslinking; if fundamental for L parasites, these enzymes could represent another promising drug target. In the thesis clinical part, subclinical L infections were evaluated in autoimmune rheumatic patients treated with immunosuppressive drugs at Ferrara Hospital in Italy. L. mexicana and L. infantum promastigotes were treated with 7.8 mM 6-AN for 24 hours and small metabolites were extracted and analysed by pHILIC-LC-MS. TGase was tested in vivo in canine L. infantum promastigotes as well as in vitro in parasite extracts using fluorescein-cadaverine. Transamidation in AS precipitated fractions was measured in microwell plates. Western blot of human L. infantum lysate and canine L. infantum extract and precipitated fractions as well as immunocytochemical analysis of canine L. infantum were performed using human TGase 2 polyclonal antibodies. L PCR and real-time PCR were performed on DNA extracted from PBMCs from 50 autoimmune rheumatic patients and 50 healthy subjects. Plasma cytokines were also measured. In both L. mexicana and L. infantum, 6-AN caused significant depletion of phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) and nicotinate and as a result purine and pyrimidine nucleotides were reduced and their nucleobases accumulated. Glutathione, ribose-5-phosphate, 6-phosphogluconate levels and downstream PPP intermediates were similar to controls. In mammals 6-AN is converted to abnormal 6-ANAD/P by NAD+ glycohydrolase, however, in L its toxicity is only seen in mM range, in which 6-AN depletes the cellular PRPP content probably in the Preiss-Handler NAD+ salvage pathway, resulting in depletion of nucleotides required for nucleic acid biosynthesis. L NAD+ glycohydrolase might decompose NAD+ but not catalyze exchange reactions as found in other microrganisms, however, combined 13C-glucose labeling and flux analysis might be useful to ascertain the fate and action mechanism of 6-AN in L. TGase was detected and confirmed in vivo and/or in vitro in human and canine L. infantum promastigotes. The activity in the canine strain was found Ca2+-dependent and inhibited by 10mM GTP. Immunocytochemistry showed fluorescent protein and blots revealed a band of 74.6 KDa for the canine strain and two bands of 55.34 KDa and 65.87 KDa for the human strain, thus the TGase pAbs (orb2986) could permit purification of this L enzyme. Eighteen autoimmune rheumatic patients were positive for L DNA by PCR and/or quantitative PCR. No statistical difference observed in relation to ownership of a dog or the type of biological drug used. Pro-inflammatory IL-1, IL-6, IL-12(p70), IL-7, IL-15, IFN-γ and TNF-α; anti-inflammatory IL-4, IL-13; and regulatory IL-10 cytokines were markedly elevated in patients with additional increase those positive for L DNA. The high L parasitaemia detected suggests that biologic treatment can lead to cryptic VL or L infection in a latent phase which may progress to full VL in the setting of immunosuppression. Molecular screening for L using PBMC fractions and cytokine analysis should be performed before treating autoimmune rheumatic patients with biologic drugs.