Dysregulated circulating microRNAs as potential new biomarkers of asbestos exposure and malignant pleural mesothelioma

Il mesotelioma maligno della pleura (MPM) è un tumore aggressivo, il cui principale fattore di rischio è l'esposizione all'amianto. L’impiego di questo minerale cancerogeno è stato bandito in Italia nel 1992, mentre in altri Paesi l’amianto è tuttora in uso, favorendo quindi l’insorgenza di MPM. Attualmente, gli strumenti diagnostici e prognostici per il MPM risultano inadeguati, ed essendo questo tumore diagnosticato quasi sempre negli stadi avanzati, risulta fatale. Pertanto l’identificazione di marcatori sensibili e specifici è di fondamentale importanza. Numerose evidenze indicano i microRNA (miRNA) come marcatori rilevabili in pazienti affetti da differenti patologie, incluso MPM. In uno studio recente, i miRNA circolanti nel siero di pazienti affetti da MPM, lavoratori ex esposti all’amianto (WEA) e soggetti sani (HS), sono stati analizzati mediante microarray e RT-qPCR. Questo studio ha permesso di identificare tre miRNA circolanti, che sono risultati deregolati nelle coorti in esame. Il limite di questi risultati era il ridotto numero di campioni (n=49). Lo scopo della mia ricerca è stato quello di verificare se i tre miRNA selezionati potessero essere validati statisticamente come nuovi marcatori di MPM e/o esposizione all’amianto. A tale fine, i sieri (n=206) di pazienti affetti da MPM (n=69), WEA (n=75) e HS (n=62), sono stati analizzati mediante RT-qPCR e droplet digital PCR (ddPCR). Inoltre, per le coorti dei WEA e MPM, sono state raccolte informazioni occupazionali e non-occupazionali, insieme alle caratteristiche clinico-patologiche, allo scopo di studiare possibili correlazioni tra i livelli dei miRNA e queste variabili. I dati ottenuti hanno confermato una alterata espressione dei tre miRNA nelle coorti in studio. Le due diverse tecniche impiegate nell’analisi di espressione dei miRNA hanno dato risultati che correlano linearmente tra loro, rafforzando quindi la significatività dei dati. Inoltre le curve ROC hanno indicato che due dei tre miRNA erano in grado di discriminare, in maniera significativa, MPM da WEA. Il terzo miRNA in studio è stato rilevato in un numero minore di campioni sierici. Tuttavia, è emerso che anche questo miRNA era deregolato nelle tre coorti, con una significativa sovra-espressione nei WEA rispetto ai HS. Complessivamente, i tre miRNA sono risultati maggiormente deregolati nella coorte dei WEA. Ciò suggerisce che questi miRNA possano essere coinvolti in pathways dell’infiammazione derivata dall’esposizione all’amianto. Da letteratura, i miRNA in studio risultano espressi in maniera aberrante in distinti tumori e altre patologie infiammatorie. Interessante notare che i target predetti e validati per i tre miRNA suggeriscono che questi siano coinvolti in pathways alterate nei processi infiammatori e/o di oncogenesi. Inoltre, è emersa una differenza significativa, nei livelli di espressione di uno specifico miRNA, tra i pazienti affetti da MPM epitelioide, rispetto a quelli con sottotipo bifasico. Lo stesso miRNA correlava negativamente con i livelli di esposizione cumulativa all’amianto. In sintesi, la mia ricerca ha permesso di validare statisticamente l’espressione aberrante dei miRNA indagati nelle coorti in studio. I risultati ottenuti evidenziano potenziali implicazioni di queste molecole nelle pathways infiammatorie associate all’esposizione all’amianto e suggeriscono che questi miRNA possano avere un ruolo nello sviluppo di MPM. Questi tre miRNA potrebbero essere proposti come potenziali marcatori: (i) di malattia, e quindi per una diagnosi precoce di MPM; (ii) del sottotipo di MPM; (iii) di esposizione all’amianto; (iv) nello specifico indicativi della durata dell’esposizione e della quantità di fibre di amianto inalate. Test minimamente invasivi, basati sulla quantificazione dei miRNA nel siero, potrebbero essere impiegati come screening per monitorare i soggetti ad alto rischio, come i lavoratori esposti all’amianto.

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is an aggressive form of cancer, in which asbestos-related chronic inflammation has been well documented. The use of asbestos was banned in Italy in 1992, whereas it is still employed in other Countries, thus favoring the MPM onset. To date, current diagnostic and prognostic assays for MPM are inadequate, whereas this tumor, being diagnosed in advanced stages, is still fatal. For these reasons, the identification of sensitive and specific MPM biomarkers is of paramount importance. Several evidences have pointed to microRNAs (miRNAs) as biomarkers detectable in patients affected by different diseases, including MPM. In a recent investigation, circulating miRNAs from serum samples of MPM patients, workers ex-exposed to asbestos fibers (WEA) and healthy subjects (HS), have been analyzed by microarray and real time quantitative PCR (RT-qPCR). This study allowed to identify three circulating miRNAs, which were found to be dysregulated in the investigated cohorts. The limitation of these results was the small sample size (n=49). The aim of my research was to verify if these dysregulated miRNAs could be statistically validated as new biomarkers of MPM and/or asbestos exposure. To this purpose, sera (n=206) from MPM affected patients (n=69), WEA (n=75) and HS (n=62) were investigated by RT-qPCR and droplet digital PCR (ddPCR). In addition, clinic-pathologic characteristics, occupational and non-occupational information, were collected for WEA and MPM cohorts, in order to check the possible correlations between miRNA levels and these variables. Data obtained confirmed a dysregulation of the three miRNAs in sera from the investigated cohorts. It is worth noting that the ddPCR results were consistent with RT-qPCR data, whereas a linear correlation between the two techniques was obtained. These aspects reinforced the value of the results. Moreover, ROC analyses indicated that two miRNAs were able to significantly discriminate MPM from WEA. The third miRNA was detected in a smaller number of serum samples. However, this miRNA was found to be dysregulated in the three cohorts, being significantly up-regulated in WEA compared to HS. Overall, the most relevant dysregulation of the investigated miRNAs resulted in the WEA cohort. This suggests that these miRNAs may be involved in inflammatory pathways, related to asbestos exposure. The three miRNAs were reported to be dysregulated in different tumors and other inflammation related diseases. It is worth noting that predicted and validated targets for these miRNAs suggest that they are potentially involved in pathways, which are dysregulated in inflammation and/or carcinogenesis. In addition, a significant difference, in the levels of a specific miRNA, emerged between patients with epithelioid MPM compared to the biphasic subtype, while this miRNA negatively correlated with cumulative asbestos exposure. In summary, my research validated the dysregulation of the investigated miRNAs in the three cohorts. Overall, my findings shed light on new potential implications of these molecules in inflammation pathways related to asbestos exposure and suggest that the three miRNAs could have a role in MPM development. These miRNAs could be proposed as potential biomarkers: (i) of disease and consequently for an early MPM diagnosis; (ii) indicative of MPM subtype; (iii) of asbestos exposure; (iv) specifically indicative of exposure duration and quantity of inhaled fibers. Minimally invasive tests, based on quantification of miRNAs in serum, could be employed for screening and monitoring high-risk subjects, as asbestos exposed workers.