THE PRESENT AND THE FUTURE OF COLLAGEN VI GENES ANALYSIS: OVERVIEW OF CELLULAR MODELS, GENOME AND TRANSCRIPTOME STUDIES

Collagen VI-related myopathies are a group of rare inherited genetic disorders with varying degree of clinical severity, caused by mutations in the Collagen type VI genes: COL6A1, COL6A2, and COL6A3. As a national reference center for diagnosis of neuromuscular disorders, 245 patients were analyzed in the Medical Genetics Unit over a 12-year period (2006-2018). The aim of this thesis is to provide a nationwide study of patients with COLVI phenotype and an overview of COL6 genes variants. The detection of mutations in collagen VI genes remains the gold standard for diagnosis, but traditional diagnostic tools do not completely achieve this goal. Next generation sequencing panel offers the ability to efficiently and cost-effectively screening all exons of the three COL6A genes. However, it is known the importance of studying transcriptome to enhance the diagnostic rate and to study the mutation functional consequence, therefore confirming their pathogenicity. In our results, the RNA-seq was shown to be the innovative strategy to explore RNA profile of COL6 genes in patients. To date, a disease cellular model for COL6-RD with the capacity to completely recapitulate the pathological phenotype in humans is yet to be established. Having this in mind, the use of Urine Stem cells (USCs) as a collagen VI cellular model was in this study developed and validated at the RNA level. Despite being a preliminary study defining whether USCs could be a good collagen VI cellular model, the data presented herein hold good promise. In contrast to skin and muscle biopsies, USCs can easily and non invasively be retrieved from urine samples. Hence, the collagen VI cellular model employing USCs with the ability to function equally well to the existing using fibroblasts could have many advantages. We propose these cells as COLVI disease in vitro model for functional studies, drug screening and validation.

Il collagene VI è una proteina della matrice extracellulare che forma un reticolo di microfilamenti nel muscolo scheletrico ed in altri organi. Le mutazioni dei geni del collagene VI causano, nell'uomo, principalmente due malattie genetiche: la miopatia di Bethlem e la distrofia muscolare congenita di Ullrich. Come centro di riferimento nazionale per le neuropatie muscolari, in 12 anni, abbiamo raccolto una casistica di 245 pazienti, indagati a livello genomico e trascrittomico, al fine di catalogare e caratterizzare le mutazioni nei tre geni del collagene VI. La casistica a livello nazionale si è dimostrata sovrapponibile a quella presente in letteratura sia per frequenza di mutazione e fenotipo, sia per tipo di mutazioni riscontrate. Considerata l’importanza di indagare il trascritto in generale nelle patologie neuromuscolari e, nello specifico, nei disordini del collagene VI, in questo lavoro abbiamo paragonato due differenti metodiche: RNA sequencing (RNAseq) e FluiCol6 micro-fluidic exome array. Il sequenziamento dell’RNA si è rivelato il miglior strumento da utilizzare, in parallelo con l’analisi genomica, nella diagnosi delle patologie del collagene VI. Al contrario, la micro-fluidic card FluiCol6 ha fornito diversi falsi positivi e si è dimostrata inefficace nell’identificare la mutazione di splicing del controllo positivo. Ad oggi manca un modello cellulare che riproduca fedelmente e in modo completo il fenotipo patologico, indotto dal deficit di collagene VI. A tale scopo si è scelto di studiare e validare le cellule staminali di origine urinaria, rivelatesi un buon modello in vitro per lo studio della Distrofia muscolare di Duchenne. I primi risultati ottenuti hanno fornito buone aspettative; le cellule staminali urinarie infatti mostrano lo stesso pattern di espressione, per i geni del collagene VI e relative isoforme, dei fibroblasti. Inoltre, i primi esperimenti di immunoistochimica rivelano la presenza della proteina nella matrice extracellulare anche se, la completa caratterizzazione proteica non è ancora conclusa. I modelli cellulari per il collagene VI, utilizzati solitamente in diagnostica e ricerca sono i fibroblasti e i mioblasti isolati da biopsie cutanee e muscolari, rispettivamente. Ottenere questi due tipi cellulari richiede l’utilizzo di metodiche invasive perciò, se le USCs si rivelassero un modello cellulare alternativo agli attuali sistemi si avrebbe la possibilità di ottenere linee cellulari in modo semplice, poco costoso, ripetibile e ben accettato dai pazienti, soprattutto da quelli in età pediatrica.