Design, synthesis and biological evaluation of novel nucleoside and oligonucleotide conjugates of bio-medical interest.

La bioconiugazione è il processo di collegamento di una molecola biologica con un'altra entità chimica. Quest’ultima può includere un'altra biomolecola: in questo caso si forma un ibrido, nel quale le proprietà delle molecole genitrici si integrano, producendo una singola entità con due differenti funzioni. Allo scopo di scoprire nuovi composti di interesse bio-medico a base di nucleosidi, abbiamo considerato la bioconiugazione una valida strategia. Alla luce del ben noto potenziale terapeutico dei nucleosidi come antitumorali e antivirali, nel primo lavoro riportato in questa tesi è stato sintetizzato un coniugato tra 2'-deossiadenosina e una molecola definita “fotogabbia”: quest’ultima è infatti in grado di rilasciare sotto stimolo luminoso ossido nitrico, la cui attività in vari sistemi bioregolatori è stata provata in recenti studi. Sono stati inoltre sintetizzati altri due bioconiugati tra la stessa fotogabbia e gli acidi biliari ursodesossicolico e chenodesossicolico, utilizzando reazioni di click chemistry. I nuovi bioconiugati sono stati sottoposti a test di citotossicità e successivamente a studi fotobiologici che ne hanno confermato la combinazione di effetti chemo- e fototerapeutici. Nel secondo lavoro è stata considerata la natura anfifilica degli acidi biliari, che li rende adeguati carrier per molecole scarsamente lipofiliche, come nel nostro caso i nucleosidi, aumentandone l’uptake cellulare. Sono quindi stati realizzati nuovi bioconiugati utilizzando reazioni CuAAC tra derivati alchinici di 2'-deossiadenosina, 2'-deossiguanosina, 2'-deossiuridina, adenosina e guanosina, e derivati azidici degli acidi cheno-, urso-, nor-cheno-, nor-urso- e taurourso-desossicolico. Test biologici e di relazione struttura-attività sui nuovi ibridi hanno mostrato come la citoselettività sia guidata principalmente dalla natura dell'acido biliare e possa essere affinata dalla natura del nucleoside. L’abilità degli acidi biliari come molecole carrier è stata sfruttata anche nel terzo lavoro: qui l’acido ursodesossicolico e altre molecole lipofiliche sono stati coniugati ad un oligonucleotide antisenso in grado di associarsi all’esone del gene della distrofina umana che è più di frequente responsabile della Distrofia Muscolare di Duchenne, in modo da migliorarne l’exon skipping. Per la sintesi dell'oligonucleotide è stata utilizzata la chimica classica del fosforoammidito in fase solida, impiegando l'oligosintetizzatore "Äkta Oligopilot Plus". Attraverso l’inserimento di adeguati linker amminici alle estremità 3' e 5' dell’oligonucleotide e all’attivazione dei gruppi carbossilici presenti sulle molecole lipofiliche come esteri N-succinimmidici, è stato possibile realizzare la bioconiugazione per mezzo di legami ammidici. In seguito ai test eseguiti in vitro e in vivo, è emerso un effettivo aumento della quantità di distrofina nelle cellule muscolari trattate con l’oligonucleotide coniugato con l’acido ursodesossicolico rispetto a quelle trattate con l’oligonucleotide non coniugato. Nell’ultimo lavoro di questa tesi, la bioconiugazione è stata utilizzata per realizzare composti biomimetici di UDP-GlcNAc, substrato naturale di glicosiltransferasi, nei quali il β-fosfato è stato rimpiazzato da una catena alchilica o da un anello triazolico. Questi nuovi composti sono poi stati studiati come inibitori di glicosiltransferasi, in quanto la disregolazione di questi enzimi è connessa a vari disturbi, tra cui cancro e malattie neurodegenerative. L’uridina monofosfato è stata coniugata con glucosio, N-acetilglucosammina o con un anello pirrolidinico sostituito in vari modi. Test enzimatici, spettroscopici e computazionali sono risultati in accordo, evidenziando come l’assenza del β-fosfato debba essere adeguatamente controbilanciata nei glicomimetici per avere inibizione a concentrazioni micromolari.

Bioconjugation is the process of linking or connecting a biological molecule with another moiety. This moiety may include another biomolecule: in this case a hybrid is formed, in which the properties of the parent molecules are integrated, yielding a single entity with two different functions. With the aim to discover new nucleoside-based compounds of bio-medical interest, we consider bioconjugation as a powerful approach. In light of the well-known therapeutic potential of nucleosides as antitumorals and antivirals, in the first work reported in this thesis a conjugate between 2'-deoxyadenosine and a molecule called "photocage" was synthesized: the latter is in fact able to release under irradiation nitric oxide, whose activity in various bioregulatory systems has been proven in recent studies. Furthermore, two other bioconjugates were synthesized between the same photocage and the ursodeoxycholic and chenodeoxycholic bile acids, using click chemistry reactions. The novel bioconjugates were subjected to cytotoxicity tests and subsequently to photobiological studies that confirmed the combination of chemo- and phototherapeutic effects. In the second work the amphiphilic nature of bile acids was considered, which makes them suitable carriers for poorly lipophilic molecules, as in our case the nucleosides, increasing their cellular uptake. Therefore, new bioconjugates were made using CuAAC reactions between 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxyguanosine, 2'-deoxyuridine, adenosine and guanosine alkyne derivatives, and azide derivatives of cheno-, urso-, nor-cheno-, nor-urso- and taurourso-deoxycholic acids. Biological and structure-activity relationship tests on new hybrids have shown that cytoselectivity is mainly driven by the nature of the bile acid and can be fine-tuned by the nature of the nucleoside. The ability of bile acids as carrier molecules has also been exploited in the third work: here the ursodeoxycholic acid and other lipophilic molecules have been conjugated to an antisense oligonucleotide able to associate with the exon of the human dystrophin gene which is more frequently responsible for Duchenne Muscular Dystrophy, in order to improve exon skipping approach. For the synthesis of the oligonucleotide the classic phosphoramidite chemistry in solid phase was used, using the oligosyntesizer "Äkta Oligopilot Plus". By inserting suitable amino linkers to the 3'- and 5'-ends of the oligonucleotide and by the activation of the carboxylic groups present on the lipophilic molecules as N-succinimide esters, it was possible to carry out the bioconjugation by means of amide bonds. Following the tests performed in vitro and in vivo, an increase in the amount of dystrophin in the muscle cells treated with the oligonucleotide conjugated with ursodeoxycholic acid has emerged compared to those treated with the unconjugated oligonucleotide. In the last work of this thesis, bioconjugation was used to synthesize biomimetic compounds of UDP-GlcNAc, a natural substrate of glycosyltransferases, in which the β-phosphate was replaced by an alkyl chain or a triazole ring. These new compounds were then studied as glycosyltransferase inhibitors, as the dysregulation of these enzymes is related to various diseases, including cancer and neurodegenerative syndromes. Uridine monophosphate was conjugated with glucose, N-acetylglucosamine or a pyrrolidine ring substituted in various ways. Enzymatic, spectroscopic and computational studies were in agreement, highlighting how the absence of β-phosphate should be adequately counterbalanced in glycomimetics to have inhibition at micromolar concentrations.