Vav1 up-modulates the tumor suppressor miR-29b in cells from acute myeloid leukemia (AML) and triple negative breast cancer (TNBC).

La deregolazione del miR-29b, un membro della famiglia miR-29 che svolge un ruolo di oncosoppressore, si verifica nella leucemia e in molti tumori solidi, incluso il cancro al seno. Livelli elevati di miR-29b correlano positivamente con la risposta agli agenti ipometilanti dei pazienti con leucemia mieloide acuta (AML) e con l’aumento della sopravvivenza nelle neoplasie mammarie. Ciò suggerisce che l’aumentata espressione di questo miRNA tramite il ripristino del suo apparato trascrizionale, generalmente down-regolato nei tumori, può migliorare gli approcci terapeutici sia nell'AML che nel tumore della mammella. Sulla base di nostri precedenti dati che dimostrano il coinvolgimento della proteina multidominio Vav1 nell'espressione del miRNA in cellule da leucemia promielocitica acuta (APL), , abbiamo studiato il possibile ruolo di Vav1 nel ripristinare i livelli di miR-29b in linee cellulari derivate AML non-APL che dal tumore alla mammella. Abbiamo riscontrato che il fattore di trascrizione PU.1 può regolare il miR-29b nelle cellule Kasumi-1, che presentano il riarrangiamento cromosomico t(8; 21), prevalente nell'AML e correlato con una sopravvivenza relativamente bassa. Abbiamo anche rilevato che l'espressione di miR-29b mediata da PU.1 dipende quasi completamente da livelli adeguati di Vav1 in cellule derivate da lucemia mieloide APL e non-APL. In particolare, abbiamo dimostrato che l'associazione nucleare PU.1/Vav1 è necessaria per la trascrizione del miR-29b e che, solo nelle cellule Kasumi-1, Vav1 fa parte dei complessi molecolari reclutati nel sito di consenso per PU.1 sul promotore del miRNA. Questi risultati aggiungono nuove informazioni sul meccanismo trascrizionale che regola l'espressione di miR-29b nelle cellule derivate da AML e possono aiutare a identificare farmaci utili nel trattamento di pazienti che possono trarre vantaggio dalle terapie basate su agenti ipometilanti. Sulla base dei risultati ottenuti nelle cellule derivate da AML, è stato esplorato il possibile coinvolgimento di Vav1 nella regolazione di miR-29b nel tumore della mammella. Una volta evidenziata una correlazione positiva tra Vav1 e miR-29b nel tumore mammario invasivo, il nostro interesse si è focalizzato sul fenotipo triplo negativo (TNBC), il sottotipo di carcinoma mammario più aggressivo con la prognosi peggiore, a causa della mancanza di terapie mirate. Nelle cellule MDA-MB-231, altamente invasive e con fenotipo triplo negativo, abbiamo confermato la correlazione positiva tra i livelli di Vav1 e l'espressione di miR-29b. In questo modello cellulare abbiamo rilevato che CEBPα, ma non PU.1, regola la trascrizione del miR-29b e che, come nelle cellule derivate da AML, questo evento è fortemente dipendente da Vav1. L'implicazione di Vav1 nell'espressione di miR-29b è stata ulteriormente studiata valutando i precursori del miRNA e i risultati, anche se preliminari, suggeriscono che Vav1 regola miR-29b sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. Abbiamo infine dimostrato che, nelle cellule MDA-MB-231, Vav1 down-modula l’espressione di Akt2, possibilmente inducendo il miR-29b, indicativo dell'esistenza di un asse Vav1/miR-29b/Akt2 in questo modello cellulare. Ciò suggerisce che strategie volte ad aumentare Vav1 potrebbero essere utili per i tumori mammari con un fenotipo triplo negativo, per il quale lo sviluppo degli inibitori di Akt è particolarmente problematico e le terapie mirate non sono attualmente disponibili. Nel complesso, i dati riportati nella tesi aggiungono nuove e sostanziali informazioni sulla regolazione dell'espressione di miR-29b nella leucemia mieloide e nel cancro della mammella e identificano Vav1 come un cruciale modulatore positivo di questo miRNA. I nostri risultati possono consentire di identificare strategie che, modificando l'asse Vav1/miR-29b, potrebbero essere utilizzate nel trattamento della leucemia e dei tumori solidi.

Dysregulation of miR-29b, a member of the miR-29 family that plays a tumor suppressor role targeting multiple oncogenes, occurs in leukemia and in many solid tumors, including breast cancer. High levels of miR-29b positively correlate with the response of patients with acute myeloid leukemia (AML) to hypomethylating agents and with survival in breast neoplasia, suggesting that up-modulation of this miRNA by restoring its transcriptional machinery, generally down-regulated in tumors, can improve therapeutic approaches in both AML and breast cancer. On the basis of our previous data indicating that, in cells from acute promyelocytic leukemia (APL), the multidomain protein Vav1 is involved in miRNA expression, we investigated the possible role of Vav1 in restoring the miR-29b level in both AML- and breast tumor-derived cell lines. We found that the transcription factor PU.1 may regulate miR-29b in the Kasumi-1 cells, showing the t(8;21) chromosomal rearrangement, which is prevalent in AML and correlated with a relatively low survival. We also demonstrated that the PU.1-mediated expression of miR-29b is almost completely dependent on adequate levels of Vav1 in both APL- and non-APL-derived cells. In particular, we revealed that the nuclear PU.1/Vav1 association is required for the transcription of miR-29b but, only in Kasumi-1 cells, Vav1 is part of molecular complexes recruited to the PU.1 consensus site. These results add new information on the transcriptional machinery that regulates miR-29b expression in AML-derived cells and may help to identify drugs useful in treatment of patients who can take advantage from hypomethylating agent-based therapies. On the basis of the results obtained in AML-derived cells, the possible involvement of Vav1 in regulating miR-29b was explored in breast tumors. Once an overall positive correlation between Vav1 and miR-29b expression was found in invasive breast tumor, our interest was mainly focused on triple-negative breast cancer (TNBC), the most aggressive breast cancer subtype with a poor prognosis, due to the lack of targeted therapies. In highly invasive triple negative MDA-MB-231 cells, we confirmed the positive correlation between Vav1 levels and miR-29b expression. In this cell model we found that CEBPα, but not PU.1, regulates the miR-29b transcription, and that, as in AML-derived cells, this event is strikingly dependent on Vav1. The implication of Vav1 in miR-29b expression was further investigated by evaluating the miRNA precursors, and the results, even if preliminary, suggest that Vav1 regulates miR-29b at both transcriptional and post-transcriptional level. Finally, we demonstrated that Vav1 down-modulates Akt2 in MDA-MB-231, possibly via up-modulation of miR-29b, indicative of the existence of a Vav1/miR-29b/Akt2 axis in this cell model. This suggest that strategies aimed to increase Vav1 could be useful for tumors with a triple-negative phenotype, for which the development of Akt inhibitors is particularly problematic and target-based therapies are not currently available. Overall, the data reported in the thesis add substantial new information about the regulation of miR-29b expression in both myeloid leukemia and breast cancer and identify Vav1 as a crucial positive modulator of this tumor suppressor miRNA. Our results can help in identifying strategies that, up-modulating the Vav1/miR-29b axis, may be useful in the treatment of leukemia and solid tumors.