Synthesis and biological evaluation of small anticancer molecules acting as tubulin polymerization inhibitors

Tra i diversi farmaci anti-cancro, quelli che agiscono a livello dei microtubuli rappresentano una delle classi di composti più efficaci al giorno d’oggi. Un gran numero di composti chimici, capaci di interagire con la tubulina e/o con i microtubuli, posseggono una interessante proprietà antimitotica e sono in grado di inibire la proliferazione cellulare interferendo con la polimerizzazione dinamica dei microtubuli. Tra questi, paclitaxel e vinblastina sono utilizzati in clinica per il trattamento di diversi tumori umani, ad esempio cancro delle ovaie, della mammella e dei polmoni. Recentemente, è stato individuato come altro target interessante nella terapia del cancro la vascolatura tumorale, sulla base dell’osservazione che diversi farmaci, in particolare i farmaci che agiscono a livello dei microtubuli, inibendo la loro polimerizzazione, possono anche comportarsi come agenti antivascolari (VDAs, vascular disrupting agents), provocando rapida interruzione dell’apporto di sostanze nutritive al tumore con conseguente morte delle cellule. Di grande rilevanza in questo contesto è la Combretastatina A-4 (CA-4), un cis-stilbene naturale isolato nel 1989 dalla corteccia del Combretum Caffrum. L’isomerizzazione del cis-doppio legame della CA-4 nella sua forma trans, rappresenta una dei più grandi svantaggi di questa molecola. Quando il cis-doppio legame isomerizza nella forma trans, termodinamicamente più stabile, si ha completa perdita dell’attività biologica. Per risolvere questo problema, il cis-doppio legame è stato sostituito da una struttura rigida eterociclica, risultando una strategia vincente per il mantenimento dell’attività. Sulla base di queste considerazioni, lo scopo della mia ricerca, descritta nel capitolo 2, è stata la progettazione di nuovi e potenti agenti anti-mitotici. Il mio lavoro si è focalizzato sulla progettazione, sintesi e ottimizzazione di due serie di derivati ossazolici 2-metil-4,5-disostituiti, nei quali l’anello ossazolico sostituisce il cis-doppio legame presente nella CA-4, con lo scopo di mantenere la sua configurazione bioattiva. Successivamente, il cis-doppio legame della struttura stilbenica è stato sostituito da un bioisosterico gruppo carbonilico, ottenendo una nuova classe di bis-arilchetoni, chiamati fenstatine. Gli analoghi delle fenstatine sono stati preparati sostituendo l’anello isovanillico con diversi anelli benzoeterociclici come ad esempio i benzofurani. Nel lavoro riportato nel capitolo 5, il nucleo 2 amino-3-(3’,4’,5’-trimetossibenzoil)benzo[b]furanico è stato selezionato per ulteriori modifiche che hanno portato alla sintesi di una serie di composti, variamente sostituiti con gruppo elettron-attrattori e elettron-donatori sulla porzione benzenica dello scheletro benzo[b]furanico. Proseguendo con la nostra ricerca di nuove classi di agenti ad attività antitubulinica, abbiamo deciso di investigare il potenziale di analoghi della fenstatina, nei quali il gruppo carbonilico è stato sostituito con un gruppo amminico. Nei capitoli 3 e 4, rispettivamente, descrivo la progettazione e sintesi di nuove serie di derivati 2-alcossicarbonil-3-(3’,4’,5’-trimetossianilino)-5-aril/eteroariltiofenici e 6-aril/eteroaril-4-(3’,4’,5’-trimetossianilino)tieno[3,2-d]pirimidinici. L’ultima serie di composti è stata progettata come target dualisti della tubulina e delle EGFR. Tutti i composti sintetizzati sono stati valutati in vitro per la loro attività anti-proliferativa, capacità di interagire con tubulina e effetti sul ciclo cellulare. Alcuni dei più attivi composti sono stati anche testati per valutarne l’attività antitumorale in vivo. I risultati mostrano che l’attività cellulare di questi composti comporta arresto mitotico, causato dall’interferenza con i processi mitotici, seguita da apoptosi.

Amongst diverse cancer small molecule drugs, those targeting microtubules represent one of the most effective classes of compounds available to date. A large number of chemically distinct compounds, binding to soluble tubulin and/or directly to tubulin in microtubules, possess significant antimitotic properties, and are able to inhibit cell proliferation by interfering with microtubule polymerization dynamics. Amongst these, paclitaxel and vinblastine are used in clinic to treat different human tumours for example those originating from cancers of ovary, mammary glands or lung. The microtubule system has long been preferential target for development of drugs because it is essential in a variety of cellular processes. More recently, tumour vasculature has become another attractive target for cancer therapy. This is thanks to the observations that several drugs, especially microtubule-targeting drugs, can also act as vascular disrupting agents (VDAs), targeting the tumour vascular network, thus causing an interruption of the supply of nutrients to the tumour, which leads to the death of the surrounding cells. Of most relevance to the work of this thesis is Combretastatin A-4 (CA-4), a natural cis-stilbene isolated in 1989 from the South-African tree Combretum Caffrum. The isomerization of the cis-double bond of CA-4 to its trans-form in solution is one of the major disadvantages of this molecule. When the cis double bond in CA-4 isomerizes to form thermally more stable trans-isomer, a result is a complete loss of biological activity. In order to address this issue, the cis-double bond was replaced by a rigid heterocyclic moiety to hinder the transformation to the trans-form which was shown to be a viable strategy to retain the activity. The goal of my research efforts described in chapter 2 was the discovery of novel and potent anti-microtubule agents. I focused on the pharmacophore exploration, synthesis and optimization of two novel series of 2-methyl-4,5-disubstituted oxazole derivatives, in which the oxazole ring replaced the cis-double bond present in CA-4 with the aim to retain its bioactive configuration. Consequently, the cis-olefine bridge of the stilbene moiety was replaced by a bioisosteric carbonyl group to obtain a new class of bisarylketones named phenstatins that resulted in the retention of the biological activity with improved physical properties. Phenstatin analogues have been prepared replacing isovanillic ring with different benzoheterocyclic ring, such as benzofuran. In the work reported in chapter 5, the 2-amino-3-(3’,4’,5’-trimethoxybenzoyl)benzo[b]furan nucleus was selected as scaffold for further modification by the synthesis of a series of compounds modified with different electron-releasing or electron-withdrawing moieties on the benzene portion of the benzo[b]furan skeleton. In continuation of our search for new class of anti-tubulin agents, we decided to investigate the potential of phenstatin analogues in which the carbonyl group was substituted with an amino moiety. In chapters 3 and 4, respectively, I describe the design and synthesis of new series of 2-alkoxycarbonyl-3-(3’,4’,5’-trimethoxyanilino)-5-aryl/heteroarylthiophene and 6-aryl/heteroaryl-4-(3’,4’,5’-trimethoxyanilino)thieno[3,2-d]pyrimidine derivatives. Last series of compounds has been designed as dual target of tubulin and EGFR. All the synthesized compounds were evaluated for their in vitro antiproliferative activity, interactions with tubulin and cell cycle effects. Some of the most active agents were also evaluated for antitumor activity in vivo. The findings indicate that the cellular actions of these agents result in mitotic arrest, caused by interference with mitosis-related processes, which is followed by apoptosis.