Coupling AAV-mediated promoterless gene-targeting to SaCas9 nuclease to efficiently correct liver metabolic diseases

Strategie di terapia genica non integrativa basate sui vettori adeno associati si sono dimostrate essere approcci terapeutici efficienti e sicuri per malattie monogeniche del fegato che affliggono gli adulti. Nonostante cio, il potenziale della terapia genica in un contesto neonatale e limitato. Infatti, in seguito alla perdita del DNA episomiale nelle cellule attivamente proliferanti, il trattamento perde di efficacia e necessita di una seconda somministrazione, la quale, pero, non e consentita a causa degli anticorpi neutralizzanti diretti verso gli antigeni del capside del vettore. La modificazione sito specifica e permanente del genoma e un alternativa valida e la tecnologia GeneRide ne e un esempio. Essa si basa sull inserzione di un cDNA terapeutico senza promotore nel locus dell albumina, a valle della sua sequenza codificante e a monte del suo codone di stop. In seguito all integrazione del transgene, mediata dalla ricombinazione spontanea favorita dalle sequenze di omologia, due proteine entrambi funzionali, l albumina e la proteina terapeutica, vengono prodotte da un mRNA chimerico. La strategia GeneRide e stata applicata al modello murino della sindrome di Crigler Najjar di tipo I, esempio di malattia monogenica del fegato e caratterizzata da una severa forma neonatale di iperbilirubinemia non coniugata. L approccio ha salvato i topi mutati dalla letalita neonatale e corretto sia le anomalie cerebrali che comportamentali. Nonostante cio, la sua efficienza e risultata limitata per un potenziale sviluppo clinico. Di conseguenza, abbiamo valutato diverse strategie sperimentali per innalzare il tasso di inserzione del gene terapeutico. Abbiamo, cosi, testato diversi composti per la loro abilita di innalzare l efficienza di integrazione. Inoltre, considerando che l’efficienza di inserzione e favorita da un quantitativo maggiore di DNA donatore, abbiamo testato anche il silenziamento di geni coinvolti nella trasduzione virale al fine di favorire la trasducibilita del vettore. Nessuno degli approcci si e rivelato utile. Essendo nota la capacita delle nucleasi ingegnerizzate di creare tagli nel doppio filamento del DNA in modo sito specifico e di innalzare, di conseguenza, il tasso di ricombinazione, abbiamo cosi deciso di testare la piattaforma CRISPRII/SaCas9. Inanzitutto, abbiamo verificato l efficienza di taglio della nucleasi SaCa9 nel sito scelto nel locus dell albumina. Successivamente, abbiamo combinato le due strategie CRISPRII SaCas9 e GeneRide utilizzando un cDNA codificante per la proteina citoplasmatica eGFP in topi neonati WT. L efficienza di integrazione è aumentata fino a 26 volte. Abbiamo, poi, testato un secondo cDNA sempre in animali WT, codificante per il fattore IX umano. La combinazione CRISPRII SaCas9-GeneRide ha innalzato il tasso di integrazione piu di 100 volte, rispetto al GeneRide senza nucleasi, ottenendo valori di fattore IX nel plasma pari al 100 200 per cento dei rispettivi valori umani nella normale popolazione. Abbiamo poi valutato la potenzialità terapeutica nel modello murino dalla sindrome di CN. Tutti i topi mutanti grazie al trattamento coniugato presentavano valori di bilirubina nel plasma comparabili a quelli WT, anche 10 mesi dopo l’infusione. Combinando le strategie CRISPRII SaCas9 e GeneRide il numero di epatociti modificati, pari al 3.6 per cento, è aumentato di 90 volte rispetto al solo trattamento GeneRide. Abbiamo in seguito valutato l istologia del fegato e del cervello, i principali marcatori di infiammazione, l espressione genica e proteica dell albumina e i potenziali siti di taglio non specifici. Non e stata rilevata alcuna differenza significativa. Con questo studio, abbiamo dimostrato un innalzamento dell efficienza di ricombinazione omologa, combinando la tecnologia GeneRide alla piattaforma CRISPRII SaCas9. La strategia terapeutica qui sviluppata grazie alla sua efficacia e al suo profilo sicuro puo essere considerata per un potenziale utilizzo clinico.

Non-integrative AAV-mediated gene therapy to the liver has been successfully applied to monogenic liver disorders affecting adults. However, its therapeutic application is limited in a paediatric setting because the episomal DNA loss in actively dividing cells results in a reduction in the efficacy of the treatment during time. Re-administration of the therapeutic transgene is not possible because of neutralizing antibodies against the AAV-capsid antigens. Gene editing overcomes these limitations by the permanent correction of the genome and, thus, is a promising therapeutic option for the treatment of monogenic liver disorders with a neonatal onset. GeneRide is a genome editing approach without nucleases based on the insertion of a promoterless therapeutic cDNA, carried by an AAV vector, into the albumin locus, just downstream its coding sequence and upstream its stop codon. After the spontaneous site-specific integration, two functional proteins, albumin and the therapeutic one, are produced from a chimeric mRNA. GeneRide was applied to a mouse model of the Crigler-Najjar type I syndrome (CNSI), an inborn error of metabolism characterized by severe neonatal unconjugated hyperbilirubinemia. The treatment was able to rescue mutant animals from neonatal lethality and to fully correct cerebellar and behavioural abnormalities, with stable and safe total bilirubin levels in plasma, lasting up to 12 months after the neonatal infusion. However, plasma bilirubin levels were higher than those of WT littermates, suggesting that an overall increase in efficacy was required for the potential translation of the approach into the clinic. Therefore, we combined GeneRide to different experimental strategies known to increase homology-directed repair (HDR) rate. We tested compounds that were reported to enhance HDR rate. We also performed siRNA-mediated knock down of genes that interfere with AAV-transduction, in order to increase the amount of the AAV-donor template in the nucleus and, thus, enhance the integration rate. We were not able to observe any increase in HDR or AAV transduction by the different tested approaches. Therefore, considering that the presence of DNA DSBs increases recombination rate by several orders of magnitude, we coupled GeneRide to the CRISPRII/SaCas9 platform. We first tested the ability of the CRISPRII/SaCas9 system to induce DSBs in the identified target site in the albumin gene. Then, we combined GeneRide to SaCas9 to target the integration of an eGFP reporter cDNA in WT neonatal mice. Coupling the two strategies enhanced gene targeting rate up to 26-fold, reaching up to 24 % of recombinant hepatocytes in some animals. Next, we tested the approach by targeting the FIX cDNA. We observed an increase in the targeting efficiency of more than 100-fold, compared to the group without nuclease, with plasma hFIX values that corresponded to 100-200 % of normal human ones, even 10 months after the vector administration. When the combined strategies were applied to CNSI mice, we fully rescued neonatal lethality and bilirubin-induced abnormalities, with total plasma bilirubin levels comparable to WT ones, lasting up to 10 months after AAV-vector infusion. Furthermore, the number of edited hepatocytes, about 3.6 %, increased up to 90-fold respect to GeneRide treatment alone, producing an amount of the therapeutic protein that was 5-6-fold higher than in WT liver. To determine the safety of the proposed approach we performed liver and brain histological analysis, measured inflammatory markers in the liver and albumin gene expression, and analysed potential off-target nuclease activity. All analysed parameters were normal in all treated mice. In conclusion, we demonstrated enhanced homologous recombination rate by coupling GeneRide to the CRISPR/SaCas9 platform. The significant improvement in therapeutic efficacy and reassuring safety profile support the potential application of the proposed approach in a clinical setting.