Integrating genetic analyses and morpho-cellular approaches to sustainably conserve the marble trout (Salmo marmoratus Cuvier, 1817) population.

La Lista Rossa IUCN del 2013 ha classificato la trota marmorata (Salmo marmoratus), già presente nell’Allegato II della Direttiva Habitat (92/43/EEC), “a maggior rischio” (CR, Critically Endangered) nonostante numerosi progetti negli ultimi decenni siano stati dedicati alla salvaguradia del taxon. Fin dall’inizio del 20esimo secolo negli habitat della trota marmorata è stata introdotta la trota fario (Salmo trutta). Questa sovrapposizione nei range di distribuzione ha avuto come risultato l’ibridazione: le trote marmorate autoctone oggigiorno sono rare, nella maggior parte dei fiumi, determinando un numero basso di riproduttori in natura e una bassa produzione di prole pura ogni anno. A tal riguardo è oggi fondamentale una corretta caratterizzazione genetica dei riproduttori per assicurare un alto livello di selezione degli esemplari da avviare alla carriera riproduttiva. Lo scopo di questo lavoro è di selezionare ceppi genetici di trota marmorata per allevare gli animali in strutture selezionate finalizzate alla conservazione di specie ittiche. A tal proposito, l’integrazione di analisi genetiche e di un approccio innovativo basato su una valutazione quali-quantitativa morfo-cellulare può portare alla creazione di una live gene-bank, ossia di un allevamento il cui scopo è quello di produrre progenie altamente selezionata per scopi di ripopolamento. 229 pesci sono stati sottoposti ad una rigida selezione fenotipica, basata su alcuni tratti morfologici peculiari, prima del trasferimento in allevamento, quindi sono stati taggati con un PIT-TAG per poterli identificare in seguito. La regione della D-loop e il gene nucleare LDH- C1* sono stati amplificati per escludere gli ibridi prima delle analisi seguenti. Per indagare la diversità genetica è stato testato un pannello di 15 loci microsatelliti su un sottoinsieme di 90 individui risultati marmorata/Mediterranea, per le analisi sul mtDNA e sul nDNA, e su un outgroup di 24 trote mediterranee (Salmo cettii). Le analisi hanno mostrato una chiara differenza tra gli individui provenienti da tre diversi bacini fluviali e di conseguenza, per le riproduzioni artificiali, le tre popolazioni sono state mantenute separate. Tuttavia, dal grafico ottenuto è stato evidente anche un inquinamento genetico nelle trote provenienti da due allevamenti e un individuo ha mostrato un’alta percentuale di somiglianza genetica con l’outgroup di trote mediterranee, confermando l’efficacia delle analisi condotte. La motilità spermatica e la concentrazione del liquido seminale sono stati misurati nell’allevamento durante la stagione riproduttiva con un microscopio ottico e il fotometro SDM6. Il liquido seminale degli individui che hanno fatto registrare i valori più alti di variabilità genetica è stato utilizzato per le fecondazioni artificiali e crioconservato per futuri accoppiamenti. Nove maschi sono stati campionati periodicamente per monitorare la possibile variazione nella concentrazione spermatica durante la stagione riproduttiva. In aggiunta è stato condotto un esperimento con la fecondazione di uova per testare alcuni prodotti commerciali. Combinare strumenti molecolari e tecnologie innovative può costituire un’importante innovazione negli allevamenti sia a scopo commerciale che di conservazione. Essere capaci di selezionare e crioconservare i gameti di riproduttori con alta variabilità genetica di trota marmorata pura è veramente importante per preservare specie in pericolo.

The 2013 IUCN Red List included the marble trout (Salmo marmoratus), already listed in Annex II of EU Habitat Directive (92/43/EEC), in the Critically Endangered (CR) category although in the last decades many project were dedicated to the conservation of the taxon. Since the beginning of the 20th century the brown trout (Salmo trutta) has been introduced in the habitat of marble trout. This overlapping of distribution range resulted into hybridization: the native marble trouts are nowadays rare in most rivers and this determines a low number of breeders in the wild and a low production of pure offsprings every year. Regarding this, nowadays is fundamental a genetic carachterization of the breeders to ensure a high level of selection of the individuals that has to be directed to the reproductive career. The aim of this work is to select genetic strains of marble trout in order to breed them in a selected structure finalised in fish species conservation. For this reason, integrating genetic analyses and an innovative approach based on morpho-cellular quali-quantitative evaluation can lead to the accomplishment of a live gene-bank, a hatchery whose aim is to breed higly selected offsprings for restocking purposes. 229 fish were submitted to a strict phenotypic selection based on some peculiar morphological traits, before the transfer in the hatchery, then were tagged with a PIT-TAG to identify them later. The D-loop region and nuclear gene LDH- C1* were amplified to exclude hybrid individuals before next analyses. On a subset of 90 individuals resulting marble/Mediterranean, for the mtDNA and nDNA analyses, and an outgroup of 24 Mediterranean trout (Salmo cettii) was run a panel of 15 microsatellites in order to investigate the genetic diversity. The analyses showed a clear difference between individuals from the three different basins therefore, for the artificial fertilization, the three populations were maintained separated. However, from the plot was also evident a genetic pollution in the trouts from two hatcheries and one individual showed even a high percentage of genetic similarity with Mediterranean trouts proving the efficacy of the analyses conducted. Sperm motility and milt concentration were measured in the hatchery during the reproductive season by dark-field microscope and SDM6 photometer. Milt from the individuals that showed higher values of genetic variability has been used for the artificial fertilization and cryopreserved for future breeding. Nine males were sampled periodically in order to monitor the possible milt concentration variation during the reproductive season. In addition an egg fertilization experiment was conducted to test some artificial fertilization product. Combining molecular tools and innovative techniques can be an important innovation in hatcheries both for commercial and conservation purposes. Being able to select and cryopreserve gametes of marble trout breeders and that carry the higher genetic variability is really important in order to maintain endangered species.