Herpetic vectors for safe, long-term gene transfer in the central nervous system

Dopo una battuta d'arresto seguita ai primi, problematici trial clinici negli anni ‘90, la terapia genica ha recentemente trovato un incoraggiante nuovo inizio. Significativi miglioramenti nell'ingegnerizzazione, nel delivery e nella sicurezza hanno posto la terapia genica in una posizione di avanguardia nella medicina moderna per il trattamento di varie malattie metaboliche, cardiovascolari, muscolari e oncologiche, con quasi 3000 studi clinici completati al 2017. Tuttavia, una delle principali sfide della terapia genica rimane lo sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso centrale (SNC). Per la stragrande maggioranza delle malattie del SNC non esistono ancora terapie curative, e la terapia genica offre un approccio nuovo che promette di compensare la mancanza di geni, di sostituire geni mutati o di produrre proteine terapeutiche. Rimangono molti ostacoli da superare, come la stabilità e la regolazione dell'espressione del transgene e la sicurezza del vettore e del transgene. Inoltre, l’approccio al cervello pone numerosi problemi che non si presentano nella terapia genica periferica, come la presenza di cellule-bersaglio post-mitotiche (i neuroni), l'eterogeneità dei tipi e dei circuiti cellulari e l'accesso limitato dovuto alla presenza della barriera emato-encefalica. Tra i tanti possibili sistemi di delivery di geni, il virus dell'Herpes Simplex di tipo 1 (HSV-1) sembra particolarmente promettente per la terapia genica del SNC. Le proprietà vantaggiose comprendono il neurotropismo naturale, l'elevata efficienza di trasduzione, la capacità di ospitare geni di elevate dimensioni e la capacità di entrare in uno stato di latenza nei neuroni. Lo scopo principale di questo progetto di dottorato è stato sviluppare nuovi strumenti di trasferimento genico basati su vettori erpetici per applicazioni terapeutiche nel SNC. La sfida è stata quella di ingegnerizzare il genoma di HSV in modo da prevenire l'espressione di geni virali tossici conservando la capacità di infettare più tipi cellulari e di esprimere più transgeni terapeutici in modo indipendente e controllato. Nello specifico, la tesi tratta la caratterizzazione in vitro e in vivo di una nuova famiglia di vettori virali difettivi per la replicazione (JΔNI), e la caratterizzazione in vivo di vettori ampliconi basati su HSV. L'attenzione è stata posta prima di tutto sulla sicurezza e sulla cinetica di espressione. In aggiunta, sono stati studiati meccanismi atti a regolare l’intensità di espressione del transgene. La scoperta principale è stata che questa nuova generazione di vettori HSV-1 esibisce una robusta e duratura espressione dei geni reporter, essenzialmente limitata ai neuroni, in assenza di segni di tossicità o di infiltrazione da parte di cellule infiammatorie. Questi nuovi vettori rappresentano quindi uno strumento promettente per la terapia genica in molte patologie del SNC.

After a dramatic stop following the initial clinical trials in 1990s, gene therapy has had an encouraging new start in recent years. Significant improvements in vector engineering, delivery, and safety have placed viral vector-based therapy at the forefront of modern medicine for the treatment of many metabolic, cardiovascular, muscular and oncologic diseases, with nearly 3000 clinical trials completed by 2017. However, one of the major challenges of gene therapy remain the development of therapeutic strategies for central nervous system (CNS) disorders. No cure is available for the vast majority of CNS diseases, and gene therapy offers a promising new approach to compensate for lacking genes, to substitute abnormal genes or to produce therapeutic proteins. Unfortunately, many different hurdles are not yet overcome, including stability and regulation of transgene expression, and safety of both the vector and the expressed transgene(s). In addition, the brain adds several challenges that do not pertain to peripheral gene therapy paradigms, such as post-mitotic target cells (neurons), heterogeneity of cell types and circuits, and limited access to the tissue due to the presence of the blood-brain barrier (BBB). Among a variety of possible gene delivery systems, the Herpes Simplex virus type 1 (HSV-1) appears to be a promising viral vector for CNS gene therapy. Advantageous properties include natural neurotropism, high transduction efficiency, large payload capacity, and the ability of enter a latent state in neurons. The primary aim of this PhD project was to develop new gene transfer tools based on herpetic vectors for application in CNS diseases. The challenge has been to genetically engineer the HSV genome to prevent expression of toxic viral genes while retaining the ability to infect multiple cell types and express multiple therapeutic transgenes under independent transcriptional control. Specifically, this thesis focuses on the in vitro and in vivo characterization of a new family of replication-defective viral vectors (JΔNI) and the in vivo characterization of amplicon vectors based on HSV. Attention has been mainly given to safety and expression kinetics. in addition, we evaluated mechanisms to regulate the strength of transgene expression. The principal finding was that this new generation of HSV-1 based vectors exhibit a robust and long-lasting expression of reporter genes, essentially limited to neurons, together with the absence of signs of toxicity or infiltration of inflammatory cells. Therefore, these vectors represent a highly promising tool for gene deliver in many CNS pathologies.