The bioavailability of an active ingredient of industrial interest is the parameter that most influences its translation to a marketable bioactive molecule. Bioavailability is largely influenced by the water solubility of the active ingredient. Most of the new chemical entities (NCE) are poorly soluble in water and therefore poorly bioavailable. To overcome these limitations, protocols can be developed to produce pro-drugs with increased solubility in water and, so, bioavailability. The modifications of the active ingredients can take place chemically or, alternatively, enzymatically. This work proposes the development of enzymatic esterification protocols of active ingredients of agri-food and pharmaceutical interest. Among the active ingredients studied, sorbic acid is the most commonly used preservative in the food industry. The antimicrobial inhibition of sorbic acid could be influenced by its lipophilic nature, which reduces its use in hydrophilic food formulations. Reactions between sorbic acid and glycerol catalyzed by lipases were studied in order to develop a novel sorbic acid derivate with a promising hydrophilic profile. The esterification reaction between sorbic acid and glycerol in a solvent-free system was performed with an immobilized lipase B from Candida antarctica (CALB). Among the active pharmaceutical ingredients studied, ibuprofen is the widely used NSAID limited in bioavailability by its poor water solubility. In this thesis, we proposed an effective optimized enzymatic process for the production of the enhanced-water soluble ibuprofen sorbitol ester prodrug. The direct enzymatic route has been optimized for: biphasic media dynamics, enzyme concentration, water content, temperature, stirring speed, substrates concentrations, and reaction time. 1H, 13C-NMR, and MS confirmed the PPL-catalyzed esterification of ibuprofen with sorbitol. To the best of our knowledge, this is the first time that enzymatic esterification of ibuprofen with sorbitol (as well as ibuprofen erythritol ester, and xylitol ester), has been proposed. This process initiates the synthesis with the biocatalytic approach of numerous bioactive molecules with increased bioavailability of pharmaceutical-industrial and agri-food interest. Moreover, we have developed an enzymatic esterification protocol emancipated from the presence of water. This monophasic protocol, for which a patent has been deposited, sees the use of a single organic solvent for the solubilization of all substrates in reaction, avoiding many of the limitations imposed by the canonical O/W biphasic systems. Finally, the enzymatically synthesized prodrugs were tested for activity. The glycerol sorbate product has been tested against Streptomices griseus bacterium and Saccharomyces cerevisiae yeast. Results indicate that the esterification of sorbic acid with glycerol does improve its antimicrobial properties against Saccharomyces cerevisie. The reported results demonstrate that esterification can be used as a strategy to improve the antimicrobial activity of sorbic acid. Ibuprofen derivatives were tested in vitro via the IB3-1 cell line from fibrocystic patients. The derivatives have been shown to maintain the anti-inflammatory activity of ibuprofen and, in some cases, appear to improve it.

La biodisponibilità di un principio attivo di interesse industriale è il parametro che più influenza la sua traduzione in una molecola bioattiva commerciale. La biodisponibilità è largamente influenzata dalla solubilità in acqua del principio attivo. La maggior parte delle new chemical entities (NCE) sono scarsamente solubili in acqua e quindi scarsamente biodisponibili. Per superare queste limitazioni, è possibile sviluppare protocolli per produrre pro-farmaci che presentino maggiore solubilità in acqua e, quindi, biodisponibilità. Le modificazioni dei principi attivi possono avvenire chimicamente o, in alternativa, enzimaticamente. Questo lavoro propone lo sviluppo di protocolli di esterificazione enzimatica di principi attivi di interesse agroalimentare e farmaceutico. Tra i principi attivi studiati, l'acido sorbico è il conservante più utilizzato nell'industria alimentare. L'inibizione antimicrobica dell'acido sorbico potrebbe essere influenzata dalla sua natura lipofila, che ne riduce l'uso nelle formulazioni alimentari. Le reazioni tra acido sorbico e glicerolo, catalizzate dalle lipasi, sono state studiate al fine di sviluppare un nuovo derivato dell'acido sorbico con un promettente profilo idrofilico. La reazione di esterificazione tra acido sorbico e glicerolo in un sistema privo di solventi è stata eseguita con una Candida antarctica lipasi B immobilizzata (CALB). Tra i principi attivi farmaceutici studiati, l'ibuprofene è un FANS ampiamente utilizzato, poco biodisponibile in quanto scarsamente solubile in acqua. In questa tesi, abbiamo proposto un processo enzimatico ottimizzato per la produzione del profarmaco sorbitol-estere di ibuprofene potenziato in termini di solubilità. L’esterificazione diretta è stata ottimizzata per: scelta del mezzo bifasico, concentrazione di enzima, contenuto di acqua, temperatura, velocità di agitazione, concentrazioni di substrati e tempo di reazione. 1H, 13C-NMR e MS hanno confermato l'esterificazione catalizzata da PPL dell'ibuprofene con sorbitolo. Per quanto a nostra conoscenza, questa è la prima volta che viene proposta l'esterificazione enzimatica dell'ibuprofene con sorbitolo (così come estere di ibuprofene con eritritolo e estere di ibuprofene con xilitolo). Questo processo da il via alla sintesi, con l'approccio biocatalitico, di numerose molecole bioattive con maggiore biodisponibilità di interesse farmaceutico-industriale e agroalimentare. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo di esterificazione enzimatica emancipato dalla presenza di acqua. Questo protocollo monofasico, per il quale è stato depositato un brevetto, vede l'utilizzo di un unico solvente organico per la solubilizzazione di tutti i substrati in reazione, evitando molte delle limitazioni imposte dai canonici sistemi bifasici O/W. Infine, i profarmaci sintetizzati enzimaticamente sono stati testati per l'attività. Il prodotto glicerolo sorbato è stato testato contro il batterio Streptomices griseus e il lievito Saccharomyces cerevisiae. I risultati indicano che l'esterificazione dell'acido sorbico con glicerolo migliora le sue proprietà antimicrobiche nei confronti di Saccharomyces cerevisie. I risultati riportati dimostrano che l'esterificazione può essere utilizzata come strategia per migliorare l'attività antimicrobica dell'acido sorbico. I derivati dell'ibuprofene sono stati testati in vitro tramite la linea cellulare IB3-1 da pazienti fibrocistici. È stato dimostrato che i derivati mantengono l'attività antinfiammatoria dell'ibuprofene e, in alcuni casi, sembrano migliorarla.

Enzymatic Processes of the Preparation of Esters of Poorly Water-Soluble Carboxylic Acids

ZAPPATERRA, FEDERICO
2021-09-15

Abstract

La biodisponibilità di un principio attivo di interesse industriale è il parametro che più influenza la sua traduzione in una molecola bioattiva commerciale. La biodisponibilità è largamente influenzata dalla solubilità in acqua del principio attivo. La maggior parte delle new chemical entities (NCE) sono scarsamente solubili in acqua e quindi scarsamente biodisponibili. Per superare queste limitazioni, è possibile sviluppare protocolli per produrre pro-farmaci che presentino maggiore solubilità in acqua e, quindi, biodisponibilità. Le modificazioni dei principi attivi possono avvenire chimicamente o, in alternativa, enzimaticamente. Questo lavoro propone lo sviluppo di protocolli di esterificazione enzimatica di principi attivi di interesse agroalimentare e farmaceutico. Tra i principi attivi studiati, l'acido sorbico è il conservante più utilizzato nell'industria alimentare. L'inibizione antimicrobica dell'acido sorbico potrebbe essere influenzata dalla sua natura lipofila, che ne riduce l'uso nelle formulazioni alimentari. Le reazioni tra acido sorbico e glicerolo, catalizzate dalle lipasi, sono state studiate al fine di sviluppare un nuovo derivato dell'acido sorbico con un promettente profilo idrofilico. La reazione di esterificazione tra acido sorbico e glicerolo in un sistema privo di solventi è stata eseguita con una Candida antarctica lipasi B immobilizzata (CALB). Tra i principi attivi farmaceutici studiati, l'ibuprofene è un FANS ampiamente utilizzato, poco biodisponibile in quanto scarsamente solubile in acqua. In questa tesi, abbiamo proposto un processo enzimatico ottimizzato per la produzione del profarmaco sorbitol-estere di ibuprofene potenziato in termini di solubilità. L’esterificazione diretta è stata ottimizzata per: scelta del mezzo bifasico, concentrazione di enzima, contenuto di acqua, temperatura, velocità di agitazione, concentrazioni di substrati e tempo di reazione. 1H, 13C-NMR e MS hanno confermato l'esterificazione catalizzata da PPL dell'ibuprofene con sorbitolo. Per quanto a nostra conoscenza, questa è la prima volta che viene proposta l'esterificazione enzimatica dell'ibuprofene con sorbitolo (così come estere di ibuprofene con eritritolo e estere di ibuprofene con xilitolo). Questo processo da il via alla sintesi, con l'approccio biocatalitico, di numerose molecole bioattive con maggiore biodisponibilità di interesse farmaceutico-industriale e agroalimentare. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo di esterificazione enzimatica emancipato dalla presenza di acqua. Questo protocollo monofasico, per il quale è stato depositato un brevetto, vede l'utilizzo di un unico solvente organico per la solubilizzazione di tutti i substrati in reazione, evitando molte delle limitazioni imposte dai canonici sistemi bifasici O/W. Infine, i profarmaci sintetizzati enzimaticamente sono stati testati per l'attività. Il prodotto glicerolo sorbato è stato testato contro il batterio Streptomices griseus e il lievito Saccharomyces cerevisiae. I risultati indicano che l'esterificazione dell'acido sorbico con glicerolo migliora le sue proprietà antimicrobiche nei confronti di Saccharomyces cerevisie. I risultati riportati dimostrano che l'esterificazione può essere utilizzata come strategia per migliorare l'attività antimicrobica dell'acido sorbico. I derivati dell'ibuprofene sono stati testati in vitro tramite la linea cellulare IB3-1 da pazienti fibrocistici. È stato dimostrato che i derivati mantengono l'attività antinfiammatoria dell'ibuprofene e, in alcuni casi, sembrano migliorarla.
BERNARDI, Francesco
TAMBURINI, Elena
PINTON, Paolo
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Descrizione: Tesi
Tipologia: Tesi di dottorato
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