The small GTPase RIT2 rescues LRRK2-dependent autophagy-lysosome pathway impairment to reduce alpha-synuclein accumulation and neurotoxicity

Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder and affects about 2-3% of the population over the age of 65. The etiology of PD is still undefined and familial cases provided hints for mechanisms involved in the disease. In particular, alpha-synuclein (aSyn) and leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene alterations lead to autosomal dominant PD with many commonalities to the idiopathic disorder. aSyn containing inclusions, termed Lewy bodies, are one of the neuropathological hallmarks of PD, but the mechanisms involved in formation, maintenance and degradation of these inclusions are still under intense investigation. Several cellular processes are hypothesized to mediate these mechanisms, with a prominent attention directed towards autophagy. Additionally, several PD risk genes have a role in lysosomal biology and autophagy itself. Recombinant neuroblastoma cell lines overexpressing WT and G2019S LRRK2 display defects at different stages of the autophagy-lysosome pathway (ALP), specifically accumulation of autophagosomes and abnormalities in lysosomal morphology and number. Interestingly, G2019S LRRK2 cells display inclusions staining positive for pS129-aSyn. Pharmacological inhibition of LRRK2 kinase activity in G2019S LRRK2 cells reverts ALP defects and most importantly reduces the number of pS129-aSyn inclusions. RIT2, coding for the protein Rin, is a novel PD gene risk factor and has been scarcely investigated. It is a small GTPase mediating neurite outgrowth through p38 and ERK1/2 MAPK signaling pathways. Moreover, Rin is enriched in rodent substantia nigra pars compacta neurons and is reduced in human PD brains. However, the relevance of Rin-dependent signaling pathways and/or its interactions with PD-causing proteins is currently lacking. We observed that RIT2 mRNA levels are reduced in WT and G2019S LRRK2 cells and also RIT2 promoter activity is reduced in these cell lines. Acute overexpression of RIT2 phenocopies the effects of LRRK2 kinase inhibitor treatment, specifically on the number of autphagosomes, morphology and number of lysosomes and their proteolytic function. Moreover, RIT2 overexpression strongly reduces the burden of pS129-aSyn inclusions. Interestingly, acute RIT2 overexpression reduces phosphorylation levels of S1292, but not S935 LRRK2, an aspect distinct from pharmacological LRRK2 kinase inhibition. Furthermore, total LRRK2 levels are not decreased with RIT2 overexpression, unlike after LRRK2 kinase inhibitor treatment. Viral overexpression of RIT2 in an in vivo aSyn mouse model ameliorates motor deficits and reduces dopaminergic neuron loss, induced by viral overexpression of aSyn. Viral aSyn overexpression induces an increase in pS1292 LRRK2 levels, indicating an enhanced activity of endogenous LRRK2. The co-expression of aSyn with RIT2 prevents the increase of LRRK2 kinase activity, indicating that RIT2 is acting on LRRK2. This data suggest that aSyn, LRRK2 and RIT2 might share common cellular mechanisms, in particular autophagy, and ultimately impact the degradation of aSyn. The modulation of RIT2 expression might constitute a new strategy to combat aSyn pathology, applicable to both familial and idiopathic PD and, possibly, other synucleinopathies.

La malattia di Parkinson (MdP) é il più comune disturbo neurodegenerativo del movimento, che colpisce circa 2-3% delle persone sopra i 65 anni di età. L´eziologia della malattia non è ancora definita ma casi familiari hanno fornito indizi sui meccanismi coinvolti nella malattia. In particolare, alterazioni genetiche nei geni codificanti alfa-sinucleina (aSyn) e leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sono alla base di forme autosomiche dominanti della malattia, le quali ricalcano le caratteristiche salienti della forma sporadica. Le inclusioni intraneuronali, definite corpi di Lewy e costituite prevalentemente da aSyn, sono uno dei segni distintivi della presentazione neuropatologica nella MP. I meccanismi coinvolti nella formazione, mantenimento e degradazione delle inclusioni sono tutt´ora oggetto di studio approfondito. Si ipotizza che diversi processi cellulari siano alla base di tali meccanismi, con una particolare attenzione rivolta all´autofagia. Inoltre, diversi geni associati ad aumento di rischio di MdP rivestono un ruolo nella biologia lisosomale e nell´autofagia stessa. Linee cellulari ricombinanti di neuroblastoma che sovra esprimono LRRK2 WT o G2019S riportano difetti in diversi stadi della via autofagia-lisosomi, in particolare accumulo di autofagosomi, alterazioni nella morfologia dei lisosomi e nel loro numero. Le cellule LRRK2 G2019S specificamente sono caratterizzate da inclusioni proteiche positive per pS129-aSyn. L´inibizione farmacologica dell´attività chinasica di LRRK2 in queste cellule corregge i deficit nella via autofagia-lisosomi e riduce il numero di inclusioni di pS129-aSyn. RIT2, che codifica per la proteina Rin, è un nuovo fattore di rischio genetico per la MdP che è stato scarsamente studiato finora. Si tratta di una piccola GTPasi che media la crescita neuritica tramite le vie di segnalazione delle MAPK p38 ed ERK1/2. Inoltre, RIT2 è arricchiato nei neuroni della substantia nigra pars compacta nei roditori e la sua espressione è ridotta nel cervello di pazienti di MdP. Tuttavia, non sono disponibili evidenze sperimentali sulle vie di segnalazione dipendenti da Rin e/o sulle eventuali interazioni con proteine legate causalmente alla MdP. Abbiamo appurato che i livelli di mRNA di RIT2 sono ridotti nelle cellule WT e G2019S LRRK2 ed inoltre l´attività del suo promotore è ridotta nelle stesse linee cellulari. La sovra espressione acuta di RIT2 produce una fenocopia del trattamento con l´inibitore chinasico di LRRK2, in riferimento al numero di autofagosomi, alla morfologia e numero di lisosomi e la loro attività proteolitica. In aggiunta, la sovra espressione di RIT2 riduce il carico di inclusioni positive per p S129-aSyn. Questa strategia inoltre riduce la fosforilazione di LRRK2 a carico della S1292, ma non della S935, e questo aspetto la differenzia dal trattamento farmacologico con inibitore di LRRK2. Inoltre, i livelli di espressione proteina totale di LRRK2 non vengono ridotti dalla sovra espressione di RIT2, a differenza di quanto accade in seguito ad inibizione farmacologica. La sovra espressione di RIT2 tramite vettori virali in un modello in vivo di tossicità di aSyn nel topo porta ad un miglioramento dell´attività motoria e riduce la perdita neuronale dopaminergica, indotta dall´espressione virale di aSyn. Inoltre, aSyn induce un aumento dei livelli di pS1292 LRRK2, indicativi di un´aumentata attività di LRRK2 endogena. La co-espressione con RIT2 previene tale aumento, suggerendo un´azione di RIT2 su LRRK2 stessa. Questi dati indicano che aSyn, RIT2 e LRRK2 sono alla base di meccanismi cellulari comuni, specialmente autofagia, e modulano a valle il catabolismo di aSyn. La modulazione dell´espressione di RIT2 potrebbe quindi costituire una nuova strategia terapeutica indirizzata alla patologia da aSyn, applicabile sia alla MdP familiare che idiopatica e, idealmente, alle altre sinucleinopatie.