Glioblastoma multiforme (GBM) is a lethal malignant brain tumor in adulthood. The standard treatment consists of surgery,radiotherapy and chemotherapy. Nevertheless, the mean patient survival time reaches only 14.6 months. The first line drug in GBM treatment is the alkylating agent temozolomide (TMZ),but drug-resistance is often an issue due to several mechanisms such as the enhanced activity of MGMT, a DNA repair enzyme, and microRNAs. Many molecular changes involving genetic and epigenetic mechanisms can lead to gliomagenesis; thus,modifications in the apoptotic pathways may not only contribute to the tumor development,but also to the resistance towards classical therapeutic genotoxic approaches. MicroRNAs (miRNAs), play a pivotal role in the development of a malignant phenotype of glioma cells;and tumorigenesis occurs as the result of imbalances between oncomiRNAs and tumor-suppressor miRNAs, both acting as gene regulators at post-transcriptional level by either repressing translation or degrading the target mRNA. The oncomiRNAs miR-155 and miR-221 are significantly elevated in GBM,downregulating multiple genes associated with cancer cell proliferation, apoptosis, invasiveness and drug resistance. The aim of this PhD thesis was to develop novel possible therapeutic interventions able to inhibit the tumor cells growth,as well as induce apoptotic cell death by sensitizing GBM cells to TMZ treatment and/or potentiating its activity. Therefore, human U251 and TMZ-resistant T98G glioma cells were studied combining: (i) the treatment with TMZ and corilagin, an interesting tannin extracted from plants of the Phillantus family, and (ii) TMZ with anti-miR-221 and anti-miR-155 PNAs. Corilagin (COR) is known to exhibit several activities,interfere with the anti-apoptotic NFkB and to induce cancer cell apoptosis,representing a potential antitumor molecule. Docking studies demonstrated that COR is able to suppress the level of NFkB by preventing its ability to bind with DNA. Upon COR treatment,U251 and T98G glioma cells showed a reduction in their proliferation, but most importantly showed increased apoptosis. Interestingly, when T98G cells were co-treated with TMZ plus COR,they reached a level of apoptosis higher than that with TMZ or COR alone. This is probably related to the decrease of MGMT mRNA expression and the activation of caspase-3 (CASP-3), an important factor involved in the apoptosis pathway;moreover,COR demonstrated to be active at inhibiting cell migration, particularly when combined with TMZ. Peptide nucleic acids (PNAs) were used by this thesis to modulate miR-155 and miR-221 expression; these miRNAs were selected from a list of miRNAs dysregulated in GBM,since they were predicted to target CASP-3 mRNA. This hypothesis was confirmed by the Bio-Plex analysis and by the Caspase 3/7 assay, after treatment of glioma cells with PNAs R8-PNA-a155 and R8-PNA-a221. Recently,it was demonstrated that R8-PNA-a221 has pro-apoptotic effects in glioma cells; thus,also the effect of R8-PNA-a155 was investigated on both U251 and T98G cells. The obtained data showed that both PNAs are selective in targeting their relative miRNA and that they induce apoptosis in both the glioma cell line models under study. In TMZ-resistant T98G cells, combining TMZ with PNAs could have a greater effect than single treatments. Co-administration of R8-PNA-a221 or R8-PNA-a155 induced apoptosis of TMZ-treated T98G cells at a level higher than that obtained following singular administration of R8-PNA-a221 or R8-PNA-a155; similar was the effect observed on apoptosis involving CASP-3 activation. In conclusion,the results reported in this PhD thesis demonstrate that apoptosis induction could be an efficient way to modulate the progression of cancer and the drug resistance. Moreover, using natural compounds or synthetic agents, such as corilagin and PNAs,respectively,could constitute an efficient and powerful strategy to potentiate TMZ activity

Il glioblastoma multiforme (GBM) è tra i tumori cerebrali più aggressivi, generalmente compare in età adulta ed è caratterizzato da eterogeneità cellulare e diverse alterazioni genetiche (Louis DN, 2016). La terapia standard consiste in una combinazione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Nonostante l’aggressività dei trattamenti, non esiste ancora una cura definitiva e il tasso medio di sopravvivenza è di soli 14,6 mesi (Wilson TA, 2014). Il farmaco di elezione nel trattamento del glioblastoma è la temozolomide (TMZ). La TMZ è un agente alchilante e viene utilizzato da solo o in combinazione con la radioterapia (Zhang J, 2012) ma, a causa dell’insorgenza di resistenza terapeutica, è un farmaco in grado soltanto di prolungare l’aspettativa di vita. Uno dei fattori responsabili dell’insorgenza di chemio-resistenza è l’aumento dell’attività dell’enzima O(6)- methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), deputato alla riparazione dei danni al DNA provocati da TMZ (Fan CH, 2013). L’insorgenza e lo sviluppo del glioblastoma sono legati a diverse alterazioni molecolari dovute a meccanismi genetici ed epigenetici; pertanto le modificazioni nel processo apoptotico potrebbero non solo contribuire allo sviluppo del tumore, ma anche allo sviluppo di resistenza verso la classica terapia genotossica (Adamson C, 2009). I microRNAs, piccole molecole di RNA non codificante, giocano un ruolo chiave nella sopravvivenza cellulare, proliferazione, angiogenesi, metastasi e nello sviluppo di un fenotipo maligno nelle cellule di glioma. La tumorigenesi è pertanto il risultato del disequilibrio tra microRNA oncogeni (oncomiRNA) e miRNA soppressori tumorali, entrambi capaci di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la repressione della traduzione o la degradazione del mRNA bersaglio. Per esempio, gli oncogeni miR-155 e miR-221, sono molto espressi nel glioblastoma e riducono l’espressione di molti geni associati alla proliferazione delle cellule cancerose, all’apoptosi, all’invasività e alla chemioresistenza (Liu Q, 2015; Xie Q, 2014; Zhang CZ, 2010; Shea A, 2016). La comprensione della patogenesi del glioma permetterebbe quindi di identificare nuovi bersagli terapeutici e di sviluppare nuovi approcci volti anche al potenziamento delle attuali terapie e/o a limitare la crescita del tumore, così come a ridurne la resistenza. Lo scopo di questa tesi è stato quello di studiare nuovi possibili approcci terapeutici in grado di inibire la crescita delle cellule tumorali, indurre la morte cellulare per apoptosi e sensibilizzare le cellule di glioblastoma al trattamento con temozolomide e/o potenziarne l’attività. Per questo studio sono state utilizzate le cellule umane di glioblastoma U251 e T98G, queste ultime resistenti alla TMZ; in seguito a trattamento combinato con (i) temozolomide e corilagina, un’interessante tannino estratto da piante della famiglia delle Phillantaceae, e (ii) con temozolomide e PNA anti-miR-155 e anti-miR-221, sono stati studiati gli effetti su alcuni meccanismi molecolari, tra i quali apoptosi, proliferazione e migrazione cellulare. La corilagina (COR) presenta proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali ed è stato dimostrato che è capace di interferire con l’anti-apoptotico NF-kB (Gambari R, 2012; Dong XR, 2010) e di indurre apoptosi in cellule tumorali (Jia L, 2013, Ming Y, 2013; Gu Y, 2016). Pertanto la corilagina potrebbe essere una molecola potenzialmente attiva nel trattamento del glioblastoma. Inizialmente, mediante studi di docking, è stato dimostrato che la corilagina è in grado di ridurre i livelli di NF-kB inibendo la sua interazione con il DNA. Dopo trattamento con COR, la proliferazione delle cellule U251 e T98G è risultata ridotta e soprattutto si è visto un aumento dello stato di apoptosi. Molto interessante è l’effetto sulle cellule resistenti alla TMZ, T98G, che quando trattate con entrambi COR e TMZ mostrano un livello di apoptosi maggiore rispetto al trattamento singolo con corilagina o temozolomide. Questo è probabilmente legato al fatto che la corilagina, ma soprattutto la corilagina combinata alla TMZ, sembrano ridurre l’espressione di MGMT e indurre l’attivazione della caspasi-3 (CASP-3); inoltre la corilagina si è dimostrata attiva anche nell’inibizione della migrazione cellulare, in particolare nel trattamento combinato. Per quanto riguarda i microRNA e il loro utilizzo come bersagli terapeutici, in questa tesi sono stati presi in considerazione i PNA anti-miR-155 e anti-miR-221. Questi microRNA sono stati selezionati da una lunga lista di microRNA alterati nel glioblastoma e che sembrano avere come target l’RNA messaggero della caspasi-3, un importante fattore coinvolto nel processo apoptotico. I risultati ottenuti dalle analisi Bio-Plex e dal saggio delle caspasi 3/7, dopo trattamento delle linee cellulari di glioma con i PNA R8-PNA-a155 e R8-PNA-a221, hanno confermato l’ipotesi che la CASP-3 è un gene target del miR-155 e del miR-221. Molto recentemente, nel nostro gruppo di ricerca, è stato dimostrato che R8-PNA-a221 ha effetti pro-apoptotici in cellule di glioma (Brognara E, 2016); così, abbiamo investigato anche gli effetti del R8-PNA-a155 sia nelle cellule U251 che T98G. I dati ottenuti hanno dimostrato che entrambi i PNA sono selettivi nel colpire il relativo microRNA e sono capaci di indurre apoptosi in entrambi i modelli cellulari di glioma studiati. Dal momento che gli oncomiRNA promuovono la crescita e la sopravvivenza cellulare, abbiamo indagato se, nelle cellule T98G resistenti alla TMZ, combinando il trattamento con TMZ e PNA si riuscivano ad ottenere risultati migliori rispetto ai singoli trattamenti. Il co-trattamento con R8-PNA-a221 o R8-PNA-a155 ha indotto apoptosi nelle cellule T98G a livelli più elevati rispetto ai livelli ottenuti con la somministrazione del solo PNA; un effetto simile è stato osservato anche per quanto riguarda l’apoptosi legata all’attivazione della caspasi-3. In conclusione, i risultati riportati in questa tesi di dottorato dimostrano che l’induzione di apoptosi, potrebbe essere un modo efficiente per modulare la progressione del cancro e la resistenza al farmaco. Con questa ricerca, quindi, abbiamo dimostrato che l’utilizzo di composti naturali o sintetici, come la corilagina o i PNA rispettivamente, potrebbe essere un’efficace strategia per potenziare l’attività della temozolomide e per rendere le cellule di glioma resistenti più sensibili all’effetto apoptotico da essa indotto.

Emerging strategies for selective targeting in therapeutic approaches against gliomas

MILANI, Roberta
2017-03-10

Abstract

Il glioblastoma multiforme (GBM) è tra i tumori cerebrali più aggressivi, generalmente compare in età adulta ed è caratterizzato da eterogeneità cellulare e diverse alterazioni genetiche (Louis DN, 2016). La terapia standard consiste in una combinazione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Nonostante l’aggressività dei trattamenti, non esiste ancora una cura definitiva e il tasso medio di sopravvivenza è di soli 14,6 mesi (Wilson TA, 2014). Il farmaco di elezione nel trattamento del glioblastoma è la temozolomide (TMZ). La TMZ è un agente alchilante e viene utilizzato da solo o in combinazione con la radioterapia (Zhang J, 2012) ma, a causa dell’insorgenza di resistenza terapeutica, è un farmaco in grado soltanto di prolungare l’aspettativa di vita. Uno dei fattori responsabili dell’insorgenza di chemio-resistenza è l’aumento dell’attività dell’enzima O(6)- methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), deputato alla riparazione dei danni al DNA provocati da TMZ (Fan CH, 2013). L’insorgenza e lo sviluppo del glioblastoma sono legati a diverse alterazioni molecolari dovute a meccanismi genetici ed epigenetici; pertanto le modificazioni nel processo apoptotico potrebbero non solo contribuire allo sviluppo del tumore, ma anche allo sviluppo di resistenza verso la classica terapia genotossica (Adamson C, 2009). I microRNAs, piccole molecole di RNA non codificante, giocano un ruolo chiave nella sopravvivenza cellulare, proliferazione, angiogenesi, metastasi e nello sviluppo di un fenotipo maligno nelle cellule di glioma. La tumorigenesi è pertanto il risultato del disequilibrio tra microRNA oncogeni (oncomiRNA) e miRNA soppressori tumorali, entrambi capaci di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la repressione della traduzione o la degradazione del mRNA bersaglio. Per esempio, gli oncogeni miR-155 e miR-221, sono molto espressi nel glioblastoma e riducono l’espressione di molti geni associati alla proliferazione delle cellule cancerose, all’apoptosi, all’invasività e alla chemioresistenza (Liu Q, 2015; Xie Q, 2014; Zhang CZ, 2010; Shea A, 2016). La comprensione della patogenesi del glioma permetterebbe quindi di identificare nuovi bersagli terapeutici e di sviluppare nuovi approcci volti anche al potenziamento delle attuali terapie e/o a limitare la crescita del tumore, così come a ridurne la resistenza. Lo scopo di questa tesi è stato quello di studiare nuovi possibili approcci terapeutici in grado di inibire la crescita delle cellule tumorali, indurre la morte cellulare per apoptosi e sensibilizzare le cellule di glioblastoma al trattamento con temozolomide e/o potenziarne l’attività. Per questo studio sono state utilizzate le cellule umane di glioblastoma U251 e T98G, queste ultime resistenti alla TMZ; in seguito a trattamento combinato con (i) temozolomide e corilagina, un’interessante tannino estratto da piante della famiglia delle Phillantaceae, e (ii) con temozolomide e PNA anti-miR-155 e anti-miR-221, sono stati studiati gli effetti su alcuni meccanismi molecolari, tra i quali apoptosi, proliferazione e migrazione cellulare. La corilagina (COR) presenta proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali ed è stato dimostrato che è capace di interferire con l’anti-apoptotico NF-kB (Gambari R, 2012; Dong XR, 2010) e di indurre apoptosi in cellule tumorali (Jia L, 2013, Ming Y, 2013; Gu Y, 2016). Pertanto la corilagina potrebbe essere una molecola potenzialmente attiva nel trattamento del glioblastoma. Inizialmente, mediante studi di docking, è stato dimostrato che la corilagina è in grado di ridurre i livelli di NF-kB inibendo la sua interazione con il DNA. Dopo trattamento con COR, la proliferazione delle cellule U251 e T98G è risultata ridotta e soprattutto si è visto un aumento dello stato di apoptosi. Molto interessante è l’effetto sulle cellule resistenti alla TMZ, T98G, che quando trattate con entrambi COR e TMZ mostrano un livello di apoptosi maggiore rispetto al trattamento singolo con corilagina o temozolomide. Questo è probabilmente legato al fatto che la corilagina, ma soprattutto la corilagina combinata alla TMZ, sembrano ridurre l’espressione di MGMT e indurre l’attivazione della caspasi-3 (CASP-3); inoltre la corilagina si è dimostrata attiva anche nell’inibizione della migrazione cellulare, in particolare nel trattamento combinato. Per quanto riguarda i microRNA e il loro utilizzo come bersagli terapeutici, in questa tesi sono stati presi in considerazione i PNA anti-miR-155 e anti-miR-221. Questi microRNA sono stati selezionati da una lunga lista di microRNA alterati nel glioblastoma e che sembrano avere come target l’RNA messaggero della caspasi-3, un importante fattore coinvolto nel processo apoptotico. I risultati ottenuti dalle analisi Bio-Plex e dal saggio delle caspasi 3/7, dopo trattamento delle linee cellulari di glioma con i PNA R8-PNA-a155 e R8-PNA-a221, hanno confermato l’ipotesi che la CASP-3 è un gene target del miR-155 e del miR-221. Molto recentemente, nel nostro gruppo di ricerca, è stato dimostrato che R8-PNA-a221 ha effetti pro-apoptotici in cellule di glioma (Brognara E, 2016); così, abbiamo investigato anche gli effetti del R8-PNA-a155 sia nelle cellule U251 che T98G. I dati ottenuti hanno dimostrato che entrambi i PNA sono selettivi nel colpire il relativo microRNA e sono capaci di indurre apoptosi in entrambi i modelli cellulari di glioma studiati. Dal momento che gli oncomiRNA promuovono la crescita e la sopravvivenza cellulare, abbiamo indagato se, nelle cellule T98G resistenti alla TMZ, combinando il trattamento con TMZ e PNA si riuscivano ad ottenere risultati migliori rispetto ai singoli trattamenti. Il co-trattamento con R8-PNA-a221 o R8-PNA-a155 ha indotto apoptosi nelle cellule T98G a livelli più elevati rispetto ai livelli ottenuti con la somministrazione del solo PNA; un effetto simile è stato osservato anche per quanto riguarda l’apoptosi legata all’attivazione della caspasi-3. In conclusione, i risultati riportati in questa tesi di dottorato dimostrano che l’induzione di apoptosi, potrebbe essere un modo efficiente per modulare la progressione del cancro e la resistenza al farmaco. Con questa ricerca, quindi, abbiamo dimostrato che l’utilizzo di composti naturali o sintetici, come la corilagina o i PNA rispettivamente, potrebbe essere un’efficace strategia per potenziare l’attività della temozolomide e per rendere le cellule di glioma resistenti più sensibili all’effetto apoptotico da essa indotto.
GAMBARI, Roberto
PINTON, Paolo
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