This thesis focused on two different proteins and their involvement in cellular homeostasis: the transcription factor EB (TFEB) and the mitochondrial aspartate-glutamate carrier isoform 1 (AGC1). The first work (chapter 1) presented is aimed to investigate the roles of TFEB and lysosomes in intracellular Ca2+ homeostasis. As well documented, lysosomes are membrane-bound organelles mainly involved in catabolic processes. In addition, lysosomes can expel their contents outside of the cell via lysosomal exocytosis. Some of the key steps involved in these important cellular processes, such as vesicular fusion and trafficking, require calcium (Ca2+) signaling. Recent data show that lysosomal functions are transcriptionally regulated by transcription factor EB (TFEB) through the induction of genes involved in lysosomal biogenesis and exocytosis. We studied the effect of transient modulation of TFEB expression in HeLa cells by measuring the cytosolic Ca2+ response after capacitative Ca2+ entry activation and Ca2+ dynamics in the endoplasmic reticulum (ER) and directly in lysosomes. Our observations show that transient TFEB overexpression significantly reduces cytosolic Ca2+ levels under a capacitative influx model and ER re-uptake of calcium, increasing the lysosomal Ca2+ buffering capacity. Moreover, lysosomal destruction or damage abolishes these TFEB-dependent effects in both the cytosol and ER. These results suggest a possible Ca2+ buffering role for lysosomes and shed new light on lysosomal functions during intracellular Ca2+ homeostasis. The second work (chapter 2) is focused on AGC1, the isoform 1 of the mitochondrial aspartate-glutamate carrier which catalyzes a Ca2+-stimulated export of aspartate to the cytosol in exchange for glutamate, and is a key component of the malate-aspartate shuttle which transfers NADH reducing equivalents from the cytosol to mitochondria. By sustaining the complete glucose oxidation, AGC1 is thought to be important in providing energy for cells, in particular in the CNS and muscle where this protein is mainly expressed. Defects in the AGC1 gene cause AGC1 deficiency, an infantile encephalopathy with delayed myelination and reduced brain N-acetylaspartate (NAA) levels, the precursor of myelin synthesis in the CNS. Here, we show that undifferentiated Neuro2A cells with down-regulated AGC1 display a significant proliferation deficit associated with reduced mitochondrial respiration, and are unable to synthesize NAA properly. In the presence of high glutamine oxidation, cells with reduced AGC1 restore cell proliferation, although oxidative stress increases and NAA synthesis deficit persists. Our data suggest that the cellular energetic deficit due to AGC1 impairment is associated with inappropriate aspartate levels to support neuronal proliferation when glutamine is not used as metabolic substrate, and we propose that delayed myelination in AGC1 deficiency patients could be attributable, at least in part, to neuronal loss combined with lack of NAA synthesis occurring during the nervous system development.

Il lavoro della mia tesi è focalizzato sullo studio di due differenti proteine e del loro coinvolgimento nel controllo dell’omeostasi cellulare: il fattore di trascrizione EB (TFEB) e l’isoforma 1 dello scambiatore mitocondriale per aspartato-glutammato (AGC1). Nella prima parte della tesi presentata (Capitolo 1) ho indagato il ruolo di TFEB e dei lisosomi nell’omeostasi del Ca2+ intracellulare. Come ben noto da letteratura, i lisosomi sono degli organelli rivestiti da membrane, coinvolti principalmente nei processi catabolici e che possono espellere il loro contenuto nell’ambiente extracellulare attraverso esocitosi. Alcuni dei processi che li vedono coinvolti, come la fusione vescicolare e il traffico degli organelli, richiedono calcio per il loro funzionamento. Recentemente è stato dimostrato che le principali funzioni lisosomiali sono regolate dal fattore di trascrizione TFEB attreverso l’attivazione dell’espressione di geni coinvolti nella biogenesi e controllo dell’esocitosi lisosomiali. Così abbiamo studiato gli effetti della modulazione transiente dell’espressione di TFEB in cellule HeLa misurando i livelli di Ca2+ citosolico e le dinamiche del Ca2+ nel reticolo endoplasmico (ER) e direttamente nei lisosomi in risposta all’attivazione dell’influsso capacitativo di Ca2+. I nostri risultati mostrano come la sovra espressione transeinte di TFEB riduca significativamente il livello di Ca2+ citosolico e la velocità di riempimento di Ca2+ del reticolo durante l’attivazione dell’influsso capacitativo, aumentando la capacità di assorbimento del catione stesso da parte dei lisosomi. Inoltre, la ditruzione o il danneggiamento dei lisosomi elimina questi effetti dipendenti da TFEB nel citosol e nel reticolo. Questi risultati suggeriscono un possibile ruolo di tampone Ca2+ dei lisosomi aprendo nuove vie sulle funzionalità di questi organelli nel controllo dell’omeostasi del Ca2+. Nella seconda parte del mio elaborato (capitolo 2) ho focalizzato la mia attenzione su AGC1, un carrier mitocondriale che catalizza l’esportazione Ca2+-inducibile di aspartato nel citosol in cambio di glutammato e rappresenta un componente chiave dello shuttle malato-aspartato che trasferisce equivalenti ridotti del NADH dal citosol al mitocondrio. Sostenendo l’ossidazione del glucosio, AGC1 è ritenuto fondamentale per il rifornimento energetico delle cellule, in particolar modo nel sistema nervoso centrale e nei muscoli dove questa proteina è maggiormente espressa. Mutazioni del gene codificante di AGC1 causano la perdita della proteina stessa, encefalopatia infantile con ritardo nella mielinizzazione e ridotti livelli encefalici di N-acetilaspartato (NAA), precursore della sintesi della mielina nel sistema nervoso centrale. Qui mostriamo come cellule N2A non differenziate con alterati livelli di AGC1, abbiano un significativo deficit di proliferazione, sebbene sia aumentato lo stress ossidativo e persista un’insufficiente sintesi del NAA. I nostri dati suggeriscono che il deficit energetico della cellula dovuto alla mancanza di AGC1 sia associato a livelli di aspartato inappropriati a supportare la proliferazione nueronale quando la glutammina non viene usata come substrato metabolico. Perciò abbiamo proposto che il ritardo di mielinizzazione nei pazienti affetti da mancanza di AGC1 potrebbe essere attribuibile alla perdita neuronale combinata alla mancanza di NAA durante lo svilupo del sistema nervoso.

TFEB and AGC1 as homeostasis regulators: soce modulation and cell proliferation control

SBANO, LUIGI
2018

Abstract

This thesis focused on two different proteins and their involvement in cellular homeostasis: the transcription factor EB (TFEB) and the mitochondrial aspartate-glutamate carrier isoform 1 (AGC1). The first work (chapter 1) presented is aimed to investigate the roles of TFEB and lysosomes in intracellular Ca2+ homeostasis. As well documented, lysosomes are membrane-bound organelles mainly involved in catabolic processes. In addition, lysosomes can expel their contents outside of the cell via lysosomal exocytosis. Some of the key steps involved in these important cellular processes, such as vesicular fusion and trafficking, require calcium (Ca2+) signaling. Recent data show that lysosomal functions are transcriptionally regulated by transcription factor EB (TFEB) through the induction of genes involved in lysosomal biogenesis and exocytosis. We studied the effect of transient modulation of TFEB expression in HeLa cells by measuring the cytosolic Ca2+ response after capacitative Ca2+ entry activation and Ca2+ dynamics in the endoplasmic reticulum (ER) and directly in lysosomes. Our observations show that transient TFEB overexpression significantly reduces cytosolic Ca2+ levels under a capacitative influx model and ER re-uptake of calcium, increasing the lysosomal Ca2+ buffering capacity. Moreover, lysosomal destruction or damage abolishes these TFEB-dependent effects in both the cytosol and ER. These results suggest a possible Ca2+ buffering role for lysosomes and shed new light on lysosomal functions during intracellular Ca2+ homeostasis. The second work (chapter 2) is focused on AGC1, the isoform 1 of the mitochondrial aspartate-glutamate carrier which catalyzes a Ca2+-stimulated export of aspartate to the cytosol in exchange for glutamate, and is a key component of the malate-aspartate shuttle which transfers NADH reducing equivalents from the cytosol to mitochondria. By sustaining the complete glucose oxidation, AGC1 is thought to be important in providing energy for cells, in particular in the CNS and muscle where this protein is mainly expressed. Defects in the AGC1 gene cause AGC1 deficiency, an infantile encephalopathy with delayed myelination and reduced brain N-acetylaspartate (NAA) levels, the precursor of myelin synthesis in the CNS. Here, we show that undifferentiated Neuro2A cells with down-regulated AGC1 display a significant proliferation deficit associated with reduced mitochondrial respiration, and are unable to synthesize NAA properly. In the presence of high glutamine oxidation, cells with reduced AGC1 restore cell proliferation, although oxidative stress increases and NAA synthesis deficit persists. Our data suggest that the cellular energetic deficit due to AGC1 impairment is associated with inappropriate aspartate levels to support neuronal proliferation when glutamine is not used as metabolic substrate, and we propose that delayed myelination in AGC1 deficiency patients could be attributable, at least in part, to neuronal loss combined with lack of NAA synthesis occurring during the nervous system development.
PINTON, Paolo
RIMESSI, Alessandro
DI VIRGILIO, Francesco
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Descrizione: Tesi_Luigi SBANO
Tipologia: Tesi di dottorato
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