Il lavoro ha coinvolto l’estrazione, l’amplificazione PCR e la definizione del profilo genetico di n. 5 elementi scheletrici, risalenti al II conflitto mondiale. I campioni ossei utilizzati sono stati rappresentati da: -n. 1 elemento femorale (aviere deceduto all’età di 20 anni); -n. 1 elemento (omero) appartenuto ad un soldato deceduto a Pianoro (BO); -n. 1 elemento (tibia) appartenuto ad un secondo soldato deceduto a Pianoro (BO); -n. 1 elemento (omero) appartenente ad un aviere i cui resti sono stati rinvenuti nella provincia di Ferrara; -n. 1 elemento femorale riferito ad un aviere (diverso da quello di cui al punto precedente) rinvenuto in provincia di Ferrara. I frammenti ossei sono stati in primo luogo trattati, secondo un metodo allestito dal laboratorio, al fine di rimuovere il terriccio, eventuale DNA esogeno e molecole inibenti. Sono stati, quindi, prelevati circa 5g di tessuto, rappresentato sia da tessuto compatto sia da tessuto spugnoso. I campioni sono stati sottoposti a n. 2 step di decalcificazione (25-30mL di EDTA 0,5M, pH 8.0-8.5) ed incubati a 4°C per 24 ore. Il processo di decalcificazione è stato monitorato mediante aggiunta di ammonio ossalato (pH 4.0) al sopranatante. I pellet ossei sono stati successivamente sottoposti a 2 step di lavaggio (25mL di H2O distillata sterile e centrifugazione a 4000rpm per 25 minuti). Per l’estrazione del DNA sono stati aggiunti 15mL di tampone di estrazione contenente Tris-HCl, EDTA, NaCl, DTT e proteinasi K, con incubazione a 56°C per 2 ore, 37°C over night ed, infine, previa aggiunta di ulteriori 40µl di proteinasi K, ulteriormente per 4 ore a 37°C. Il materiale è stato, quindi, sottoposto n. 3 estrazioni in fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25-24-1) e concentrato mediante micro concentratori Centricon 30. Gli eluiti DNA sono stati sottoposti ad amplificazione PCR (NGM kit – 31 cicli), allestendo opportuni replicati come previsto dagli attuali protocolli in tema di DNA degradato, e ad elettroforesi capillare mediante ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Ogni fase analitica è stata minitorata inserendo i controlli negativi (estrazione / amplificazione) ed i controlli positivi (amplificazione). L’analisi dei tracciati elettroforetici ha consentito di ottenere n. 5 profili genetici parziali (6-9 marcatori STR) distinti che potranno essere verosimilmente utilizzati per indagini comparative volte alla restituzione dei resti scheletrici ad eventuali prossimi congiunti ancora in vita.
Recupero ed identificazione di DNA da resti scheletrici umani ultra cinquantenari
Fabbri M.
Primo
Writing – Original Draft Preparation
;Venturi M.Secondo
Validation
;Ferronato C.Membro del Collaboration Group
;Tarantino S.Membro del Collaboration Group
;Gaudio R. M.Writing – Review & Editing
;Avato F. M.Supervision
2012
Abstract
Il lavoro ha coinvolto l’estrazione, l’amplificazione PCR e la definizione del profilo genetico di n. 5 elementi scheletrici, risalenti al II conflitto mondiale. I campioni ossei utilizzati sono stati rappresentati da: -n. 1 elemento femorale (aviere deceduto all’età di 20 anni); -n. 1 elemento (omero) appartenuto ad un soldato deceduto a Pianoro (BO); -n. 1 elemento (tibia) appartenuto ad un secondo soldato deceduto a Pianoro (BO); -n. 1 elemento (omero) appartenente ad un aviere i cui resti sono stati rinvenuti nella provincia di Ferrara; -n. 1 elemento femorale riferito ad un aviere (diverso da quello di cui al punto precedente) rinvenuto in provincia di Ferrara. I frammenti ossei sono stati in primo luogo trattati, secondo un metodo allestito dal laboratorio, al fine di rimuovere il terriccio, eventuale DNA esogeno e molecole inibenti. Sono stati, quindi, prelevati circa 5g di tessuto, rappresentato sia da tessuto compatto sia da tessuto spugnoso. I campioni sono stati sottoposti a n. 2 step di decalcificazione (25-30mL di EDTA 0,5M, pH 8.0-8.5) ed incubati a 4°C per 24 ore. Il processo di decalcificazione è stato monitorato mediante aggiunta di ammonio ossalato (pH 4.0) al sopranatante. I pellet ossei sono stati successivamente sottoposti a 2 step di lavaggio (25mL di H2O distillata sterile e centrifugazione a 4000rpm per 25 minuti). Per l’estrazione del DNA sono stati aggiunti 15mL di tampone di estrazione contenente Tris-HCl, EDTA, NaCl, DTT e proteinasi K, con incubazione a 56°C per 2 ore, 37°C over night ed, infine, previa aggiunta di ulteriori 40µl di proteinasi K, ulteriormente per 4 ore a 37°C. Il materiale è stato, quindi, sottoposto n. 3 estrazioni in fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25-24-1) e concentrato mediante micro concentratori Centricon 30. Gli eluiti DNA sono stati sottoposti ad amplificazione PCR (NGM kit – 31 cicli), allestendo opportuni replicati come previsto dagli attuali protocolli in tema di DNA degradato, e ad elettroforesi capillare mediante ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Ogni fase analitica è stata minitorata inserendo i controlli negativi (estrazione / amplificazione) ed i controlli positivi (amplificazione). L’analisi dei tracciati elettroforetici ha consentito di ottenere n. 5 profili genetici parziali (6-9 marcatori STR) distinti che potranno essere verosimilmente utilizzati per indagini comparative volte alla restituzione dei resti scheletrici ad eventuali prossimi congiunti ancora in vita.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
