Estrazione di DNA da matrice ossea: modifica al protocollo secondo Hochmeister et Al. (1991)

Il lavoro proposto ha coinvolto la messa a punto di una metodica estrattiva del DNA, rivolta a matrici biologiche rappresentate da resti scheletrici umani. La metodica estrattiva in uso al laboratorio, nell’estrazione del DNA da matrici ossee e seguita nell’allestimento del nuovo metodo proposto, era rappresentata da quella elaborata da Hochmeister et Al. (J. For. Sci. 1991, 36(6), pp 1649-1661). Il nuovo protocollo sperimentale, predisposto dal laboratorio mediante l’allestimento di opportune prove sperimentali, ha visto l’introduzione di alcune modifiche al vecchio metodo che si sono rivelate di grande utilità nel recupero di DNA da tali matrici biologiche che, nella comune pratica di laboratorio, rappresentano campioni particolarmente difficoltosi da trattare. Le modificazioni predette hanno coinvolto, principalmente, la preparazione del campione osseo, le concentrazioni, i volumi ed il pH delle soluzioni impiegate, le temperature ed i tempi di incubazione, ed, infine, la velocità (rpm) ed il tempo di centrifugazione. Le modificazioni illustrate sono state apportate al precedente protocollo (Hochmeister et Al., J. For. Sci. 1991, 36(6), pp 1649-1661) grazie alla valutazione dei parametri predetti, studiando il loro influsso sull’intero processo analitico, predisponendo differenti range di variazione di ognuno dei parametri indicati al fine di raggiungere condizioni operative in grado di consentire il recupero, in termini di quantità e qualità, di DNA utile alle successive fasi di amplificazione PCR e tipizzazione genetica. Il nuovo protocollo sperimentale ha permesso di conseguire risultati quantitativamente superiori, in termini di marcatori STR obiettivati in elettroforesi capillare a parità di kit amplificativo utilizzato (NGM Kit), rispetto al vecchio protocollo a parità di matrice ossea analizzata. Di particolare aiuto ed utilità analitica si sono rivelate le modifiche apportate al pH della soluzione utilizzata nella decalcificazione della matrice ossea ed alle concentrazioni dei composti utilizzati per l’allestimento del tampone di digestione. Un’ulteriore miglioria analitica osservata è stata rappresentata dalle temperature di incubazione del campione meno aggressive e protratte per un periodo di tempo maggiore; tale fatto, consente di intaccare in proporzione minore la struttura del DNA già compromessa dal tempo e dalle condizioni ambientali alle quali il reperto osseo è stato precedentemente sottoposto.