Temporal lobe epilepsy (TLE) arises in the limbic system of the brain, often after a latency period that follows a lesional event. During the latency phase (epileptogenesis) patients are apparently well, and the diagnosis of epilepsy is possible only when seizures begin to occur. Currently available antiepileptic drugs (AEDs) are effective for the treatment of the symptoms (seizures) but not for curing the disease. Furthermore, more than 30% of TLE patients are resistant to pharmacological treatments and, just for a small percentage of them, the only option is the surgical resection of the epileptogenic area. Epileptogenesis is characterized by cellular and molecular modifications that transform a healthy brain in epileptic. The modifications occurring during epileptogenesis include “long-lasting” changes to gene expression and alterations in the release of neurotransmitters, like glutamate and GABA, which lead to an unbalance between excitation and inhibition. In this thesis, I first investigated the role of microRNAs (miRNAs) in regulating pathogenetic mechanisms in the laser-microdissected dentate gyrus (DG) of epileptic rats, at different time points of the disease, and in drug-resistant patients that underwent surgery. Microarray analysis identified 64 miRNAs that are differentially expressed in the different phases of the disease (early and late latency, first spontaneous seizure and chronic stage) in the rat pilocarpine model of epilepsy. The comparison between epileptic rats and human DG revealed an overlap of 4 miRNAs (miR-21-5p, miR-23a-5p, miR-146a-5p and miR-181c-5p). Changes observed in rats, however, may be model specific. A meta-analysis of different available datasets, obtained from the DG of animals made epileptic with different models of TLE, detected the dys-regulation of 44 and 8 miRNAs, respectively in the latency and in the chronic stages. Thus, these altered levels of miRNAs may be considered as diseasespecific rather than model-specific. Moreover, a combinatorial histopathological and miRNAs signature identified miR-487a as highly expressed in human samples without granule cell pathology-type 2, a histological pattern that associates with a better prognosis after surgery. These findings suggest miR-487a as a putative biomarker for establishing the prognosis after surgery. In addition, levels of circulating miRNAs have been studied with a 2 Abstract microarray strategy, highlighting a significant up-regulation of the brain-enriched miR-9a-3p in plasma samples of rats killed in the early latency phase, suggesting its role as a putative biomarker of epileptogenesis. Integrated analysis of transcriptional networks with genetic susceptibility data and phenotypic information allows to connect specific transcriptional programs to disease states. A computational analysis on TLE patients, pilocarpine-treated mice and pentilentetrazoleinduces seizures in zebrafish identified the gene Sestrin 3 (SESN3) as a trans-regulator of a pro-convulsant gene network. SESN3-KO rats shown a significant delay in status epilepticus onset after pilocarpine injection. Moreover, a behavioral analysis of these rats revealed a phenotype less anxious and less prone to depression. These findings suggest a role of SESN3 as a common regulator of seizure onset and of comorbid disorders associated to epilepsy. Seizure onset in the chronic stage of the disease may be due to an unbalance between excitatory and inhibitory neurotransmission. In this thesis, GABA and glutamate levels have been investigated through intra-cranial microdialysis at different phases of the disease in the rat pilocarpine model. The study revealed a significant impairment of GABA release starting with the first spontaneous seizure, when GABA-A receptor desensitization is also observed. In contrast, significantly higher levels of glutamate have been found in the hippocampus of epileptic rats, and may play a role in the maintenance of a chronic epileptic condition. Taken together, the results presented in this thesis suggest a role of specific brainenriched miRNAs and SESN3 as putative epigenetic regulators of mechanisms that can lead to epilepsy. MicroRNAs that are particularly relevant in the phase of epileptogenesis and may be further investigated as novel therapeutic targets for the treatment of epilepsy. Moreover, altered circulating levels of miRNAs in the early stages of latency have great potential for becoming biomarkers to help identifying those patients that will develop epilepsy after a brain lesion. In addition, miRNAs whose expression levels are modified and the gene SESN3 may be helpful for understanding the mechanisms of seizure onset and drugs-resistance. Indeed, analysis of the predicted targets of these miRNAs highlighted their involvement in the regulation of GABA and glutamate receptors that are already established actors in the pathogenesis of epilepsy.

L’epilessia del lobo temporale (TLE) origina nel sistema limbico del cervello, spesso dopo un periodo di latenza che segue un evento lesionale. Durante la fase di latenza (epilettogenesi) i pazienti stanno apparentemente bene e la diagnosi di epilessia è possibile solamente quando compaiono le crisi. I farmaci antiepilettici ad oggi disponibili sono efficaci per il trattamento dei sintomi (le crisi epilettiche), ma per la cura dell’epilessia. Inoltre, più del 30% dei pazienti affetti da epilessia del lobo temporale diventano resistenti al trattamento farmacologico e, solo per una piccola percentuale di essi, l’unica alternativa è la resezione chirurgica del focus epilettico. L’epilettogenesi è caratterizzata da modificazioni cellulari e molecolari che trasformano un cervello da sano a epilettico. Questi cambiamenti, che avvengono durante la fase di epilettogenesi, includono modifiche “a lungo termine” di espressione genica e alterazioni nel rilascio di neurotrasmettitori, come glutammato e GABA, che portano ad uno sbilanciamento tra eccitazione e inibizione nervosa. In questa tesi, ho studiato il ruolo dei microRNA (miRNA) nella regolazione di meccanismi patogenetici nel giro dentato (DG) isolato con la tecnica della microdissezione laser, in ratti epilettici a diversi time point della malattia e in pazienti farmacoresistenti che si sono sottoposti alla chirurgia. L’analisi microarray ha identificato 64 miRNA differenzialmente espressi in diverse fasi della patologia (latenza precoce e tardiva, al momento della prima crisi spontanea e in fase cronica) nel modello animale della pilocarpina nel ratto. Lo studio comparativo tra i ratti epilettici (in fase cronica) e il giro dentato di pazienti farmacoresistenti ha rivelato una sovrapposizione di 4 miRNA (miR-21-5p, miR-23a5p, miR-146a-5p e miR-181c-5p). Tuttavia, cambiamenti nell’espressione di miRNA nel ratto potrebbero essere modello-specifici e non direttamente riconducibili alla malattia. Quindi, è stata effettuata una meta-analisi di vari set di dati disponibili, ottenuti da DG di animali resi epilettici attraverso l’impiego di diversi modelli di epilessia del lobo temporale. Questa meta-analisi ha identificato la deregolazione di 44 e 8 miRNA, rispettivamente nelle fasi di latenza e cronica. Le alterazioni, così identificate, possono essere considerate malattia-specifiche, piuttosto che direttamente riconducibili al modello animale utilizzato. Inoltre, uno studio istopatologico combinato ad un’indagine microarray ha rivelato il miR-487a come maggiormente espresso in campioni di pazienti senza patologia dei granuli di tipo 2, un pattern istologico associato una migliore prognosi dopo l’intervento chirurgico. Questi risultati suggeriscono, quindi, un ruolo di miR-487a come biomarcatore nell’identificazione di una corretta prognosi dopo l’intervento del chirurgo. Per approfondire il ruolo dei miRNA come biomrcatori di patologia, uno studio di microarray è stato quindi condotto su campioni di plasma ottenuti da ratti epilettici in tutte le fasi della patologia, evidenziando una significativa up-regolazione di miR9a-3p (miRNA cervello specifico) nella fase di latenza precoce, rivelando grandi potenzialità come biomarcatore di epilettogenesi. Analisi di reti trascrizionali integrate con dati di suscettibilità genetica e informazioni fenotipiche permettono di indagare specifici programmi trascrizionali connessi a diversi stadi della patologia. Un’analisi computazionale effettuata su campioni ottenuti da pazienti affetti da epilessia del lobo temporale, topi resi epilettici con il modello della pilocarpina e zebrafish in cui le “crisi” sono state indotte con pentilentetrazolo ha portato all’identificazione del gene Sestrina 3 (Sesn3) come un trans-regolatore di un network di geni cosiddetti “proconvulsivanti”. Ratti knock out per il gene Sesn3 hanno mostrato un significativo ritardo nel raggiungimento dello stato epilettico dopo la somministrazione di pilocarpina. Inoltre, all’analisi comportamentale è stato osservato un fenotipo meno ansioso con una minore predisposizione allo sviluppo di depressione. Questi risultati suggeriscono un ruolo di Sesn3 come un regolatore genico comune nella comparsa di crisi e di comorbidità associate all’epilessia. L’insorgenza di crisi nella fase cronica della patologia potrebbe essere dovuta ad uno sbilanciamento tra le neurotrasmissioni eccitatoria ed inibitoria nel sistema nervoso centrale. In questa tesi, i livelli di GABA e glutammato sono stati studiati attraverso una microdialisi intra-cranica in animali resi epilettici con il modello della pilocarpina, attraverso diverse fasi della malattia. Si è osservato un significativo peggioramento nel rilascio di GABA a partire dalla prima crisi spontanea, in concomitanza ad una desensibilizzazione dei recettori GABAA. In contrasto, sono stati trovati significativamente alti livelli di glutammato, in ippocampo di ratti epilettici suggerendone un ruolo nel mantenimento della condizione epilettica, nella fase tardiva della malattia. Tutti insieme, i risultati presentati in questa tesi evidenziano un ruolo di specifici miRNA neuronali e Sesn3 come putativi regolatori di meccanismi che possono portare all’insorgenza dell’epilessia. I miRNA che sono particolarmente rilevanti nella fase di epilettogenesi, potrebbero quindi essere ulteriormente studiati come nuovi bersagli terapeutici per la cura dell’epilessia. Inoltre, alterati livelli plasmatici di miRNA circolanti, nella fase di epilettogenesi, rivelano un grande potenziale di queste molecole a divenire biomarcatori per l’identificazione di quei pazienti che svilupperanno la TLE in seguito ad un insulto cerebrale. Infine, lo studio quei miRNA per i quali i livelli di espressione risultano alterati, e Sesn3, risulta utile per una migliore comprensione di quei meccanismi che sono alla base della formazione delle crisi e della farmacoresistenza nei pazienti affetti. Infatti, l’analisi dei target predetti di questi miRNA ha evidenziato RNA messaggeri coinvolti nella regolazione dei recettori per il GABA e glutammato, i quali sono attori già validati nella patogenesi dell’epilessia.

New putative therapeutic targets and biomarkers of epileptogenesis: epigenetic, computational and neurochemical analyses

RONCON, PAOLO
2016

Abstract

L’epilessia del lobo temporale (TLE) origina nel sistema limbico del cervello, spesso dopo un periodo di latenza che segue un evento lesionale. Durante la fase di latenza (epilettogenesi) i pazienti stanno apparentemente bene e la diagnosi di epilessia è possibile solamente quando compaiono le crisi. I farmaci antiepilettici ad oggi disponibili sono efficaci per il trattamento dei sintomi (le crisi epilettiche), ma per la cura dell’epilessia. Inoltre, più del 30% dei pazienti affetti da epilessia del lobo temporale diventano resistenti al trattamento farmacologico e, solo per una piccola percentuale di essi, l’unica alternativa è la resezione chirurgica del focus epilettico. L’epilettogenesi è caratterizzata da modificazioni cellulari e molecolari che trasformano un cervello da sano a epilettico. Questi cambiamenti, che avvengono durante la fase di epilettogenesi, includono modifiche “a lungo termine” di espressione genica e alterazioni nel rilascio di neurotrasmettitori, come glutammato e GABA, che portano ad uno sbilanciamento tra eccitazione e inibizione nervosa. In questa tesi, ho studiato il ruolo dei microRNA (miRNA) nella regolazione di meccanismi patogenetici nel giro dentato (DG) isolato con la tecnica della microdissezione laser, in ratti epilettici a diversi time point della malattia e in pazienti farmacoresistenti che si sono sottoposti alla chirurgia. L’analisi microarray ha identificato 64 miRNA differenzialmente espressi in diverse fasi della patologia (latenza precoce e tardiva, al momento della prima crisi spontanea e in fase cronica) nel modello animale della pilocarpina nel ratto. Lo studio comparativo tra i ratti epilettici (in fase cronica) e il giro dentato di pazienti farmacoresistenti ha rivelato una sovrapposizione di 4 miRNA (miR-21-5p, miR-23a5p, miR-146a-5p e miR-181c-5p). Tuttavia, cambiamenti nell’espressione di miRNA nel ratto potrebbero essere modello-specifici e non direttamente riconducibili alla malattia. Quindi, è stata effettuata una meta-analisi di vari set di dati disponibili, ottenuti da DG di animali resi epilettici attraverso l’impiego di diversi modelli di epilessia del lobo temporale. Questa meta-analisi ha identificato la deregolazione di 44 e 8 miRNA, rispettivamente nelle fasi di latenza e cronica. Le alterazioni, così identificate, possono essere considerate malattia-specifiche, piuttosto che direttamente riconducibili al modello animale utilizzato. Inoltre, uno studio istopatologico combinato ad un’indagine microarray ha rivelato il miR-487a come maggiormente espresso in campioni di pazienti senza patologia dei granuli di tipo 2, un pattern istologico associato una migliore prognosi dopo l’intervento chirurgico. Questi risultati suggeriscono, quindi, un ruolo di miR-487a come biomarcatore nell’identificazione di una corretta prognosi dopo l’intervento del chirurgo. Per approfondire il ruolo dei miRNA come biomrcatori di patologia, uno studio di microarray è stato quindi condotto su campioni di plasma ottenuti da ratti epilettici in tutte le fasi della patologia, evidenziando una significativa up-regolazione di miR9a-3p (miRNA cervello specifico) nella fase di latenza precoce, rivelando grandi potenzialità come biomarcatore di epilettogenesi. Analisi di reti trascrizionali integrate con dati di suscettibilità genetica e informazioni fenotipiche permettono di indagare specifici programmi trascrizionali connessi a diversi stadi della patologia. Un’analisi computazionale effettuata su campioni ottenuti da pazienti affetti da epilessia del lobo temporale, topi resi epilettici con il modello della pilocarpina e zebrafish in cui le “crisi” sono state indotte con pentilentetrazolo ha portato all’identificazione del gene Sestrina 3 (Sesn3) come un trans-regolatore di un network di geni cosiddetti “proconvulsivanti”. Ratti knock out per il gene Sesn3 hanno mostrato un significativo ritardo nel raggiungimento dello stato epilettico dopo la somministrazione di pilocarpina. Inoltre, all’analisi comportamentale è stato osservato un fenotipo meno ansioso con una minore predisposizione allo sviluppo di depressione. Questi risultati suggeriscono un ruolo di Sesn3 come un regolatore genico comune nella comparsa di crisi e di comorbidità associate all’epilessia. L’insorgenza di crisi nella fase cronica della patologia potrebbe essere dovuta ad uno sbilanciamento tra le neurotrasmissioni eccitatoria ed inibitoria nel sistema nervoso centrale. In questa tesi, i livelli di GABA e glutammato sono stati studiati attraverso una microdialisi intra-cranica in animali resi epilettici con il modello della pilocarpina, attraverso diverse fasi della malattia. Si è osservato un significativo peggioramento nel rilascio di GABA a partire dalla prima crisi spontanea, in concomitanza ad una desensibilizzazione dei recettori GABAA. In contrasto, sono stati trovati significativamente alti livelli di glutammato, in ippocampo di ratti epilettici suggerendone un ruolo nel mantenimento della condizione epilettica, nella fase tardiva della malattia. Tutti insieme, i risultati presentati in questa tesi evidenziano un ruolo di specifici miRNA neuronali e Sesn3 come putativi regolatori di meccanismi che possono portare all’insorgenza dell’epilessia. I miRNA che sono particolarmente rilevanti nella fase di epilettogenesi, potrebbero quindi essere ulteriormente studiati come nuovi bersagli terapeutici per la cura dell’epilessia. Inoltre, alterati livelli plasmatici di miRNA circolanti, nella fase di epilettogenesi, rivelano un grande potenziale di queste molecole a divenire biomarcatori per l’identificazione di quei pazienti che svilupperanno la TLE in seguito ad un insulto cerebrale. Infine, lo studio quei miRNA per i quali i livelli di espressione risultano alterati, e Sesn3, risulta utile per una migliore comprensione di quei meccanismi che sono alla base della formazione delle crisi e della farmacoresistenza nei pazienti affetti. Infatti, l’analisi dei target predetti di questi miRNA ha evidenziato RNA messaggeri coinvolti nella regolazione dei recettori per il GABA e glutammato, i quali sono attori già validati nella patogenesi dell’epilessia.
SIMONATO, Michele
CUNEO, Antonio
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