Innovative strategies for a personalized therapy of β-thalassemia and sickle cell anemia

Hemoglobinopathies are genetic inherited defects that originate from the lack or malfunction of the hemoglobin (Hb) protein. Sickle cell disease (SCD) and β-thalassemia, both prototypical Mendelian single gene disorders affecting the β-globin gene have the most impact on morbidity and mortality, involving millions of people worldwide (Weatherall, 2010). β-thalassemia defects result in an imbalance accumulation of α- and β-globin proteins inside red blood cells (RBCs). This condition causes red cell membrane damage, early cell death, and ineffective erythropoiesis. SCD is due to a mutation that outcomes in a substitution of the sixth amino acid of adult β-globin. Hemoglobin tetramers bearing this mutation (HbS) polymerize inside RBCs and distort them; this rigid sickle RBCs can block blood vessels in the microcirculation compromising oxygen delivery to tissues. The current routines therapies, besides transfusion and iron chelation, include the treatment with Hydroxyurea (HU), the only fetal hemoglobin (HbF) inducer approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Despite this, treatments with HU generate sufficient levels of HbF in only half of patients (Steinberg et al., 1997) and side effects including leukopenia and neutropenia are frequently reported. Therefore, novel therapeutic inducers must be identified in order to develop a personalized treatment of patients with β-thalassemia and sickle cell anemia. Severe clinical complications of β-thalassemia and SCD may occur due to the accumulation of free α-globins or to the production of defective β-globin, respectively. Therefore, we investigated also the reduction of hemoglobin as a potential pathway to target for developing new therapies. Part I of this PhD thesis focuses on the characterization of novel fetal hemoglobin inducers: 1) by collecting 33 blood samples from different patients with β-thalassemia, we have demonstrated the action of Rapamycin to induce fetal hemoglobin production, even in HU-resistant cells; 2) during the in vivo administration to β-thalassemia patients of a Resveratrol-containing nutraceutical we have analyzed the expression of γ-globin mRNA and the production of fetal hemoglobin in erythroid precursors cells; 3) we have tested new psoralens analogues by evaluating the erythroid differentiation of K562 cells and the effects on globin genes expression and HbF production in erythroid precursors cells. Part II is concerned about the potential therapeutic application of peptide nucleic acids (PNAs) in erythroid cells: 1) in human erythroleukemia cells we obtained an efficient liposomemediated delivery of PNA with low antiproliferative activity (Avitabile et al. 2015); 2) an antisense PNA targeting β-globin mRNA was found to inhibit hemoglobin production in murine erythroleukemia cells (Montagner et al., 2015); 3) a PNA-anti-β-glob-SCA was tested in erythroid precursors cells isolated from SCD patients.

Le emoglobinopatie sono difetti genetici ereditari che originano dal malfunzionamento della proteina adibita al trasporto dell’ossigeno, cioè l’emoglobina (Hb). Tra le emoglobinopatie, l’anemia falciforme (SCD) e la β-talassemia, malattie genetiche che coinvolgono il gene βglobinico, hanno il maggior impatto sulla mortalità e sullo stato patologico e affliggono milioni di persone nel mondo (Weatherall, 2010). Nella β-talassemia, il difetto a carico del gene β-globinico causa uno squilibrio tra le catene α- e β-globiniche nei globuli rossi (RBCs). Questa condizione porta al danno delle membrane cellulari dei globuli rossi, morte precoce ed eritropoiesi inefficace. L’anemia falciforme è dovuta ad una mutazione a cui consegue la sostituzione del sesto amminoacido della β-globina adulta. L’emoglobina che porta questa mutazione (HbS) polimerizza all’interno dei globuli rossi deformandoli e rendendoli più rigidi; questi globuli rossi a falce bloccano il flusso sanguigno nella microcircolazione compromettendo il rilascio dell’ossigeno nei tessuti. Le terapie correnti di queste patologie, oltre alle trasfusioni e alla somministrazione di ferro chelanti, prevedono il trattamento con Idrossiurea (HU), l’unico induttore di emoglobina fetale approvato dalla U.S. Food and Drug Administration (FDA). Ciononostante, la terapia con Idrossiurea raggiunge livelli di emoglobina fetale sufficienti solo nella metà dei pazienti (Steinberg et al., 1997) ed spesso vengono riportati effetti collaterali tra i quali la neutropenia e la leucopenia. Perciò, risulta necessario identificare nuovi induttori di emoglobina fetale per sviluppare una terapia personalizzata per i pazienti affetti da β-talassemia ed anemia falciforme. Complicazioni cliniche severe della β-talassemia e dell’anemia falciforme possono presentarsi rispettivamente in seguito all’accumulo di catene libere α-globiniche o alla produzione di catene β-globiniche difettose. Perciò abbiamo sperimentato la riduzione di emoglobine come potenziale pathway da colpire per sviluppare nuove terapie. La parte I di questa tesi è focalizzata sulla caratterizzazione di nuovi induttori di emoglobina fetale: 1) raccogliendo 33 campioni di sangue da diversi pazienti affetti da β-talassemia abbiamo dimostrato la capacità della Rapamicina di aumentare la produzione di emoglobina fetale, anche in cellule resistenti al trattamento con Idrossiurea; 2) durante la somministrazione di un integratore alimentare a base di Resveratrolo a pazienti β-talassemici abbiamo analizzato l’induzione del messaggero γ-globinico e la produzione di emoglobina fetale nei precursori eritroidi isolati dal sangue periferico; 3) abbiamo testato nuovi composti psoralenici valutando il grado di differenziamento eritroide in cellule eritroleucemiche umane K562 e osservato gli effetti sull’espressione dei geni globinici e sulla produzione di emoglobina fetale nei precursori eritroidi. La parte II di questa tesi è volta a dimostrare l’applicazione terapeutica degli acido peptido nucleici (PNA) nelle cellule eritroidi: 1) abbiamo ottenuto un rilascio efficiente e veloce dei PNA nelle cellule eritroleucemiche umane mediante la coniugazione con una formulazione liposomica, senza evidenti effetti sulla proliferazione (Avitabile et al. 2015); 2) un PNA antisenso diretto contro il messaggero β-globinico è risultato capace di inibire la produzione di emoglobina nelle cellule eritroleucemiche murine (Montagner et al., 2015); 3) un PNA diretto contro la β-globina mutata è stato testato nei precursori eritroidi isolati da pazienti affetti da anemia falciforme.